Множественный сайт клонирования

Сайт множественного клонирования ( MCS ), также называемый полилинкером , представляет собой короткий сегмент ДНК , который содержит множество (до ~20) сайтов рестрикции — стандартная особенность сконструированных плазмид . ^[1] Сайты рестрикции внутри MCS обычно уникальны и встречаются в пределах данной плазмиды только один раз. Целью MCS в плазмиде является обеспечение возможности вставки фрагмента ДНК в эту область. ^[2]

MCS обнаруживается в различных векторах, включая векторы клонирования для увеличения количества копий целевой ДНК, а также в векторах экспрессии для создания белкового продукта. ^[3] В векторах экспрессии MCS расположена ниже промотора . ^[2]

Создание сайта множественного клонирования

В некоторых случаях вектор может не содержать MCS. Скорее, MCS можно добавить к вектору. ^[4] Первым шагом является создание комплементарных олигонуклеотидных последовательностей, которые содержат сайты рестрикции, а также дополнительные основания на конце, которые комплементарны вектору после расщепления. Затем олигонуклеотидные последовательности можно отжигать и лигировать в расщепленный и очищенный вектор. Переваренный вектор разрезают рестриктазой, которая дополняет выступающие части олигонуклеотидной вставки. После лигирования преобразуйте вектор в бактерии и проверьте вставку путем секвенирования. Этот метод также можно использовать для добавления новых сайтов рестрикции к множественному сайту клонирования.

Использование

Множественные сайты клонирования позволяют вставлять чужеродную ДНК, не разрушая остальную часть плазмиды, что делает ее чрезвычайно полезной в биотехнологии , биоинженерии и молекулярной генетике . ^[1] MCS может помочь в создании трансгенных организмов, более известных как генетически модифицированные организмы (ГМО), с использованием генной инженерии. Чтобы воспользоваться преимуществами MCS в генной инженерии, интересующий ген должен быть добавлен к вектору во время производства, когда MCS разрезается. ^[5] После того, как MCS будет изготовлен и лигирован, он будет включать интересующий ген и может быть амплифицирован для увеличения количества копий гена в бактерии-хозяине. После репликации бактерии интересующий ген можно извлечь из бактерии. В некоторых случаях вектор экспрессии можно использовать для создания белкового продукта. После того, как продукты выделены, они могут найти широкое применение, например, в производстве инсулина , создании вакцин , производстве антибиотиков и создании методов генной терапии.

Пример

Одной из бактериальных плазмид, используемых в генной инженерии в качестве вектора для клонирования плазмид, является pUC18. Его полилинкерная область состоит из нескольких сайтов узнавания ферментов рестрикции, которые были объединены в один кластер (полилинкер). Он имеет сайты рестрикции для различных ферментов рестрикции, включая EcoRI , BamHI и PstI . Другим вектором, используемым в генной инженерии, является pUC19 , который похож на pUC18, но его полилинкерная область перевернута. E.coli также широко используется в качестве бактериального хозяина из-за ее доступности, быстрой скорости роста и универсальности. ^[6] Примером плазмидного вектора для клонирования, который модифицирует вставленный белок, является плазмида pFUSE-Fc .

Чтобы создать генно-инженерный инсулин, первым шагом является разрезание MCS в используемой плазмиде. ^[7] После разрезания MCS можно добавить ген человеческого инсулина, сделав плазмиду генетически модифицированной. После этого генетически модифицированную плазмиду помещают в бактерию-хозяина и позволяют ей делиться. Чтобы обеспечить требуемый большой запас, клетки-хозяева помещают в большой резервуар для ферментации, который является оптимальной средой для хозяина. Процесс завершается фильтрацией инсулина из организма хозяина. Затем можно провести очистку, чтобы инсулин можно было упаковать и распределить среди людей с диабетом.

Ссылки

^ Jump up to: ^а ^б Кларк Д.П. (2005). Молекулярная биология . Академическая пресса. п. 611. ИСБН 0-12-175551-7 .
^ Jump up to: ^а ^б «Аддген: что такое плазмида?» . www.addgene.org . Проверено 29 апреля 2018 г.
^ Картер, Ши, Мэтт, Дженнифер (2015). Руководство по методам исследования в неврологии . Эльзевир. стр. 219–237. {{cite book}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
^ «Как создать идеальную MCS» (PDF) . Аддген . 28 апреля 2018 г.
^ «BBC - Биология стандартного уровня Bitesize - Перепрограммирование микробов: Редакция, страница 2» . Проверено 29 апреля 2018 г.
^ «Инструменты генной инженерии | Безграничная микробиология» . Courses.lumenlearning.com . Проверено 29 апреля 2018 г.
^ «Что такое генная инженерия?» . Проверено 29 апреля 2018 г.

[:0-1] Jump up to: ^а ^б Кларк Д.П. (2005). Молекулярная биология . Академическая пресса. п. 611. ИСБН 0-12-175551-7 .

[:1-2] Jump up to: ^а ^б «Аддген: что такое плазмида?» . www.addgene.org . Проверено 29 апреля 2018 г.

[3] Картер, Ши, Мэтт, Дженнифер (2015). Руководство по методам исследования в неврологии . Эльзевир. стр. 219–237. {{cite book}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )

[4] «Как создать идеальную MCS» (PDF) . Аддген . 28 апреля 2018 г.

[5] «BBC - Биология стандартного уровня Bitesize - Перепрограммирование микробов: Редакция, страница 2» . Проверено 29 апреля 2018 г.

[6] «Инструменты генной инженерии | Безграничная микробиология» . Courses.lumenlearning.com . Проверено 29 апреля 2018 г.

[7] «Что такое генная инженерия?» . Проверено 29 апреля 2018 г.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]