✖


Jump to content

Методы генной инженерии

Часть серии о
Генная инженерия
 
Генетически модифицированные организмы
История и регулирование
Процесс
Приложения
Споры

Методы генной инженерии позволяют модифицировать геномы животных и растений . Были разработаны методы вставки, удаления и модификации ДНК на нескольких уровнях: от конкретной пары оснований в конкретном гене до целых генов. (ГМО) , необходимо выполнить ряд шагов генетически модифицированный организм Прежде чем будет создан . Генные инженеры должны сначала выбрать, какой ген они хотят вставить, изменить или удалить. Затем ген необходимо выделить и включить вместе с другими генетическими элементами в подходящий вектор . Затем этот вектор используется для вставки гена в геном хозяина, создавая трансгенный или отредактированный организм.

Способность создавать генетически модифицированные организмы основана на многолетних исследованиях и открытиях функций генов и манипуляций с ними. Важные достижения включали открытие ферментов рестрикции , ДНК-лигазы , а также развитие полимеразной цепной реакции и секвенирования .

Добавленные гены часто сопровождаются промоторными и терминаторными областями, а также селектируемым маркерным геном. Добавленный ген сам может быть модифицирован для более эффективной экспрессии . Затем этот вектор вставляется в геном организма-хозяина. У животных ген обычно встраивают в эмбриональные стволовые клетки , тогда как у растений его можно встроить в любую ткань, которую можно культивировать в полностью развитое растение.

Тесты проводятся на модифицированном организме, чтобы гарантировать стабильную интеграцию, наследование и экспрессию. Потомство первого поколения гетерозиготно , что требует инбредного скрещивания для создания гомозиготного образца, необходимого для стабильного наследования. Гомозиготность должна быть подтверждена в образцах второго поколения.

Ранние методы случайным образом вставляли гены в геном. Достижения позволяют нацеливаться на определенные места, что снижает непредвиденные побочные эффекты. Ранние методы основывались на мегануклеазах и нуклеазах с цинковыми пальцами . С 2009 года были разработаны более точные и простые в реализации системы. эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN), и система Cas9-guideRNA (адаптированная из CRISPR Двумя наиболее распространенными являются ).

История

[ редактировать ]
Смотрите также: История генной инженерии

Множество различных открытий и достижений привели к развитию генной инженерии . Генетические манипуляции, направляемые человеком, начались с одомашнивания растений и животных посредством искусственного отбора примерно в 12 000 году до нашей эры. [1] : 1  Были разработаны различные методы, помогающие в разведении и селекции. Гибридизация была одним из способов внесения быстрых изменений в генетический состав организма. Гибридизация сельскохозяйственных культур, скорее всего, впервые произошла, когда люди начали выращивать генетически различные особи родственных видов в непосредственной близости. [2] : 32  Некоторые растения удалось размножить путем вегетативного клонирования . [2] : 31 

Генетическая наследственность была впервые обнаружена Грегором Менделем в 1865 году после экспериментов по скрещиванию гороха. [3] В 1928 году Фредерик Гриффит доказал существование «преобразующего принципа», участвующего в наследственности, который в 1944 году был идентифицирован как ДНК Освальдом Эйвери, Колином МакЛаудом и Маклином Маккарти . Фредерик Сэнгер разработал метод секвенирования ДНК в 1977 году, что значительно увеличило объем генетической информации, доступной исследователям.

После открытия существования и свойств ДНК необходимо было разработать инструменты, позволяющие манипулировать ею. В 1970 году лаборатория Гамильтона Смита обнаружила ферменты рестрикции , которые позволили ученым изолировать гены из генома организма. [4] ДНК-лигазы , соединяющие разорванную ДНК, были открыты ранее в 1967 году. [5] Объединив два фермента, стало возможным «разрезать и вставлять» последовательности ДНК для создания рекомбинантной ДНК . Плазмиды , открытые в 1952 г. [6] стали важными инструментами для передачи информации между клетками и репликации последовательностей ДНК. Полимеразная цепная реакция (ПЦР), разработанная Кэри Маллисом в 1983 году, позволила амплифицировать (реплицировать) небольшие участки ДНК и способствовала идентификации и выделению генетического материала.

Помимо манипулирования ДНК, необходимо было разработать методы ее внедрения в геном организма. Эксперимент Гриффита уже показал, что некоторые бактерии обладают способностью естественным образом поглощать и экспрессировать чужеродную ДНК . Искусственная компетентность была вызвана у Escherichia coli в 1970 году путем обработки их раствором хлорида кальция (CaCl 2 ). [7] Трансформация с помощью электропорации была разработана в конце 1980-х годов, что позволило повысить эффективность и расширить спектр бактерий. [8] бактерия Agrobacterium tumefaciens В 1907 году была открыта , вызывающая опухоли растений. В начале 1970-х годов было обнаружено, что эта бактерия встраивает свою ДНК в растения с помощью Ti-плазмиды . [9] Удалив из плазмиды гены, вызвавшие опухоль, и добавив новые гены, исследователи смогли заразить растения A. tumefaciens и позволить бактериям встроить выбранную ими ДНК в геномы растений. [10]

Выбор целевых генов

[ редактировать ]

Первым шагом является идентификация целевого гена или генов для вставки в организм-хозяин. Это обусловлено целью конечного организма. В некоторых случаях поражаются только один или два гена. Для более сложных целей целые пути биосинтеза, могут быть задействованы включающие множество генов. Однажды обнаруженные гены и другая генетическая информация из широкого спектра организмов могут быть вставлены в бактерии для хранения и модификации, создавая генетически модифицированные бактерии в процессе . Бактерии дешевы, их легко выращивать, они клонируются , быстро размножаются, относительно легко трансформируются и могут храниться при температуре -80 °C практически неограниченное время. Как только ген выделен, он может храниться внутри бактерий, обеспечивая неограниченный запас для исследований. [11]

генетический скрининг Для определения потенциальных генов можно провести , за которым последуют другие тесты, выявляющие лучших кандидатов. Простой скрининг включает в себя случайную мутацию ДНК с помощью химикатов или радиации, а затем отбор тех, которые демонстрируют желаемый признак. Что касается организмов, для которых мутация нецелесообразна, ученые вместо этого ищут среди популяции особей, у которых данная характеристика проявляется в результате естественных мутаций. Процессы, которые изучают фенотип , а затем пытаются определить ответственный за него ген, называются прямой генетикой . Затем ген необходимо картировать путем сравнения наследования фенотипа с известными генетическими маркерами . Гены, расположенные близко друг к другу, скорее всего, будут наследоваться вместе. [12]

Другой вариант — обратная генетика . Этот подход предполагает нацеливание на конкретный ген с помощью мутации и последующее наблюдение за развитием фенотипа. [12] Мутация может быть разработана так, чтобы инактивировать ген или позволить ему стать активным только при определенных условиях. Условные мутации полезны для идентификации генов, которые обычно летальны, если не функционируют. [13] Поскольку гены со схожими функциями имеют схожие последовательности ( гомологичные ), можно предсказать вероятную функцию гена, сравнивая его последовательность с последовательностью хорошо изученных генов модельных организмов . [12] Развитие микрочипов , транскриптомов и секвенирования генома значительно облегчило поиск желаемых генов. [14]

Бактерия Bacillus thuringiensis была впервые обнаружена в 1901 году как возбудитель гибели тутового шелкопряда . Благодаря этим инсектицидным свойствам бактерии использовались в качестве биологического инсектицида , коммерчески разработанного в 1938 году. В 1956 году было обнаружено, что белки Cry обеспечивают инсектицидную активность, а к 1980-м годам ученые успешно клонировали ген, кодирующий этот белок, и экспрессировали его. это у растений. [15] Ген, обеспечивающий устойчивость к гербициду глифосату, был обнаружен после семи лет поисков у бактерий, живущих в сливной трубе производственного предприятия Monsanto RoundUp . [16] У животных большинство используемых генов представляют собой гены гормона роста . [17]

Генные манипуляции

[ редактировать ]

Все процессы генной инженерии включают модификацию ДНК. Традиционно ДНК выделяли из клеток организмов. Позже гены стали клонировать из сегмента ДНК после создания библиотеки ДНК или синтезировать искусственно . После выделения к гену добавляются дополнительные генетические элементы, позволяющие ему экспрессироваться в организме хозяина и способствующие селекции.

Экстракция из клеток

[ редактировать ]
Основная статья: экстракция ДНК

Сначала клетку необходимо осторожно открыть , обнажая ДНК, не причиняя ей слишком большого ущерба. Используемые методы различаются в зависимости от типа клетки. После открытия ДНК необходимо отделить от других клеточных компонентов. Разрушенная клетка содержит белки и другие клеточные остатки. Путем смешивания с фенолом и/или хлороформом с последующим центрифугированием нуклеиновые кислоты можно отделить от этого мусора в верхнюю водную фазу . Эту водную фазу можно удалить и при необходимости дополнительно очистить, повторяя стадии фенол-хлороформа. Нуклеиновые кислоты затем можно осаждать из водного раствора с использованием этанола или изопропанола . Любую РНК можно удалить, добавив рибонуклеазу , которая ее разрушит. Многие компании сейчас продают комплекты, которые упрощают этот процесс. [18]

Изоляция генов

[ редактировать ]

Исследователи гена, который хотят модифицировать (известный как интересующий ген), должны быть отделены от извлеченной ДНК. Если последовательность неизвестна, то распространенным методом является разделение ДНК методом случайного переваривания. Обычно это достигается с помощью ферментов рестрикции (ферментов, разрезающих ДНК). Частичный расщепление рестрикции разрезает только некоторые сайты рестрикции, что приводит к перекрытию сегментов фрагмента ДНК. Фрагменты ДНК помещают в отдельные плазмидные векторы и выращивают внутри бактерий. Попав в бактерии, плазмида копируется по мере деления бактерий . Чтобы определить, присутствует ли полезный ген в конкретном фрагменте, библиотека ДНК проверяется на желаемый фенотип . Если фенотип обнаружен, возможно, бактерия содержит целевой ген.

Если ген не имеет обнаруживаемого фенотипа или библиотека ДНК не содержит правильного гена, для его выделения необходимо использовать другие методы. Если положение гена можно определить с помощью молекулярных маркеров , то прогулка по хромосоме является одним из способов выделения правильного фрагмента ДНК. Если ген проявляет близкую гомологию с известным геном другого вида, его можно выделить путем поиска в библиотеке генов, которые близко соответствуют известному гену. [19]

Для известных последовательностей ДНК можно использовать ферменты рестрикции, разрезающие ДНК по обе стороны гена. Затем гель-электрофорез сортирует фрагменты по длине. [20] Некоторые гели могут разделять последовательности, отличающиеся одной парой оснований . ДНК можно визуализировать, окрашивая ее бромидом этидия и фотографируя в УФ-свете . Рядом с ДНК можно положить маркер с фрагментами известной длины , чтобы оценить размер каждой полосы. Полоса ДНК правильного размера должна содержать ген, после чего его можно будет вырезать из геля. [18] : 40–41  Другой метод выделения генов известных последовательностей включает полимеразную цепную реакцию (ПЦР). [21] ПЦР — мощный инструмент, позволяющий амплифицировать заданную последовательность, которую затем можно выделить с помощью гель-электрофореза. Его эффективность падает с увеличением размера генов, и он может внести ошибки в последовательность.

можно искусственно Гены синтезировать . [22] Некоторые синтетические последовательности доступны коммерчески, при этом многие из этих ранних этапов отсутствуют. [23]

Модификация

[ редактировать ]

Вставляемый ген должен сочетаться с другими генетическими элементами, чтобы он работал правильно. На этом этапе ген можно модифицировать для лучшей экспрессии или эффективности. Помимо гена, который необходимо встроить, большинство конструкций содержат промотор и терминаторную область, а также селектируемый маркерный ген. Промоторная область инициирует транскрипцию гена и может использоваться для контроля местоположения и уровня экспрессии гена, тогда как терминаторная область завершает транскрипцию. Выбираемый маркер, который в большинстве случаев придает устойчивость к антибиотикам организму, в котором он экспрессируется, используется для определения того, какие клетки трансформируются новым геном. Конструкции изготавливаются с использованием методов рекомбинантной ДНК , таких как рестриктазы , лигирование и молекулярное клонирование . [24]

Вставка ДНК в геном хозяина

[ редактировать ]
Основная статья: Доставка генов

После того как ген создан, он должен быть стабильно интегрирован в геном целевого организма или существовать в виде внехромосомной ДНК . Существует ряд методов внедрения гена в геном хозяина, и они различаются в зависимости от типа целевого организма. У многоклеточных эукариотов , если трансген клетки хозяина включен в зародышевые , полученная клетка-хозяин может передать трансген своему потомству . Если трансген встроен в соматические клетки, трансген не может передаваться по наследству. [25]

Трансформация

[ редактировать ]
Основная статья: Трансформация (генетика)
Бактериальная трансформация включает перемещение гена от одной бактерии к другой. Он интегрирован в плазмиду реципиента. и затем может быть выражен новым хостом.

Трансформация — это прямое изменение генетических компонентов клетки путем прохождения генетического материала через клеточную мембрану . Около 1% бактерий естественным образом способны поглощать чужеродную ДНК , но эта способность может быть индуцирована и у других бактерий. [26] Стресс бактерий тепловым шоком или электропорацией может сделать клеточную мембрану проницаемой для ДНК, которая затем может быть включена в геном или существовать в виде внехромосомной ДНК. Обычно клетки инкубируют в растворе, содержащем двухвалентные катионы (часто хлорид кальция ) в холодных условиях, а затем подвергают воздействию теплового импульса (теплового шока). Хлорид кальция частично разрушает клеточную мембрану, что позволяет рекомбинантной ДНК проникнуть в клетку-хозяина. Предполагается, что воздействие на клетки двухвалентными катионами в холодном состоянии может изменить или ослабить структуру клеточной поверхности, сделав ее более проницаемой для ДНК. Считается, что тепловой импульс создает тепловой дисбаланс в клеточной мембране, который заставляет ДНК проникать в клетки либо через клеточные поры, либо через поврежденную клеточную стенку. Электропорация - еще один метод повышения компетентности. В этом методе клетки кратковременно подвергают электрическому полю напряженностью 10–20 кВ /см, которое, как полагают, создает отверстия в клеточной мембране, через которые может проникнуть плазмидная ДНК. После удара электрическим током отверстия быстро закрываются механизмами восстановления клеточной мембраны. Поглощенная ДНК может либо интегрироваться с бактериальным геномом, либо, что чаще всего, существовать в виде внехромосомная ДНК .

Генная пушка использует биолистику для внедрения ДНК в растительную ткань.
A. tumefaciens прикрепляется к клетке моркови

В растения ДНК часто встраивают с помощью Agrobacterium рекомбинации, опосредованной . [27] используя преимущества Agrobacterium последовательности Т-ДНК , которая обеспечивает естественную вставку генетического материала в растительные клетки. [28] Растительные ткани разрезают на мелкие кусочки и замачивают в жидкости, содержащей взвешенные агробактерии . Бактерии прикрепляются ко многим растительным клеткам, обнаженным в результате порезов. Бактерии используют конъюгацию для переноса сегмента ДНК, называемого Т-ДНК, из своей плазмиды в растение. Перенесенная ДНК направляется в ядро ​​растительной клетки и интегрируется в геномную ДНК растения-хозяина. Плазмидная Т-ДНК полуслучайным образом интегрируется в геном клетки-хозяина. [29]

Модифицируя плазмиду для экспрессии интересующего гена, исследователи могут стабильно вставлять выбранный ген в геном растения. Единственными важными частями Т-ДНК являются два небольших (25 пар оснований) пограничных повтора, по крайней мере один из которых необходим для трансформации растений. [30] [31] Гены, подлежащие введению в растение, клонируют в вектор трансформации растения , который содержит участок Т-ДНК плазмиды . Альтернативный метод – агроинфильтрация . [32] [33]

Другой метод, используемый для трансформации растительных клеток, — это биолистика , при котором частицы золота или вольфрама покрывают ДНК, а затем выстреливают в молодые растительные клетки или эмбрионы растений. [34] Некоторый генетический материал проникает в клетки и трансформирует их. Этот метод может быть использован на растениях, не восприимчивых к агробактериальной инфекции, а также позволяет трансформировать растительные пластиды . Растительные клетки также можно трансформировать с помощью электропорации, при которой с помощью электрического шока клеточная мембрана становится проницаемой для плазмидной ДНК. Из-за повреждения клеток и ДНК эффективность трансформации биолистики и электропорации ниже, чем агробактериальной трансформации. [ нужна ссылка ]

Трансфекция

[ редактировать ]
Основная статья: Трансфекция

Трансформация имеет другое значение по отношению к животным, указывая на переход в раковое состояние, поэтому процесс, используемый для внедрения чужеродной ДНК в клетки животных, обычно называется трансфекцией. [35] Существует множество способов прямого введения ДНК в клетки животных in vitro . Часто эти клетки представляют собой стволовые клетки , которые используются для генной терапии . Химические методы используют природные или синтетические соединения для формирования частиц, которые облегчают перенос генов в клетки. [36] Эти синтетические векторы обладают способностью связывать ДНК и обеспечивать большие генетические переносы. [37] Один из самых простых методов предполагает использование фосфата кальция для связывания ДНК и последующее воздействие на нее культивируемых клеток. Раствор вместе с ДНК инкапсулируется клетками . [38] Липосомы и полимеры можно использовать в качестве векторов для доставки ДНК в культивируемые клетки животных. Положительно заряженные липосомы связываются с ДНК, тогда как можно сконструировать полимеры, взаимодействующие с ДНК. [36] Они образуют липоплексы и полиплексы соответственно, которые затем поглощаются клетками. Другие методы включают использование электропорации и биолистики. [39] В некоторых случаях трансфицированные клетки могут стабильно интегрировать внешнюю ДНК в свой собственный геном. Этот процесс известен как стабильная трансфекция . [40]

Для создания трансгенных животных ДНК необходимо вставить в жизнеспособные эмбрионы или яйца. Обычно это достигается с помощью микроинъекции клетки , при которой ДНК вводится через ядерную оболочку непосредственно в ядро . [26] Суперовулированные оплодотворенные яйцеклетки собирают на стадии единичных клеток и культивируют in vitro . Когда пронуклеусы головки спермия и яйцеклетки видны сквозь протоплазму, в одно из них вводится генетический материал. ооцит . имплантируют в яйцевод животного псевдобеременного Затем [41] Другой метод — перенос генов, опосредованный эмбриональными стволовыми клетками. Ген трансфицируют в эмбриональные стволовые клетки , а затем их встраивают в бластоцисты мышей , которые затем имплантируют приемным матерям. Полученное потомство является химерным , и дальнейшее спаривание может привести к появлению мышей, полностью трансгенных с интересующим геном. [42]

Трансдукция

[ редактировать ]
Основная статья: Трансдукция (генетика)

Трансдукция — это процесс, посредством которого чужеродная ДНК вводится в клетку вирусом или вирусным вектором . [43] Генетически модифицированные вирусы могут использоваться в качестве вирусных векторов для переноса целевых генов в другой организм при генной терапии . [44] Сначала из вируса удаляются вирулентные гены и вместо них встраиваются целевые гены. Последовательности, которые позволяют вирусу внедрять гены в организм хозяина, должны быть оставлены нетронутыми. Популярные вирусные векторы созданы на основе ретровирусов или аденовирусов . Другие вирусы, используемые в качестве векторов, включают лентивирусы , вирусы оспы и вирусы герпеса . Тип используемого вируса будет зависеть от целевых клеток и от того, будет ли ДНК изменена навсегда или временно.

Регенерация

[ редактировать ]

Поскольку зачастую генетическим материалом трансформируется только одна клетка, организм необходимо регенерировать из этой единственной клетки. У растений это достигается за счет использования культуры тканей . [45] [46] У каждого вида растений разные требования для успешной регенерации. В случае успеха этот метод дает взрослое растение, содержащее трансген в каждой клетке. [47] У животных необходимо убедиться, что вставленная ДНК присутствует в эмбриональных стволовых клетках . [27] Потомство можно проверить на наличие этого гена. Все потомки первого поколения гетерозиготны по вставленному гену и должны быть инбредными для получения гомозиготного экземпляра. [ нужна ссылка ] Бактерии состоят из одной клетки и размножаются клонально, поэтому регенерация не требуется. Селективные маркеры используются для облегчения дифференциации трансформированных клеток от нетрансформированных.

Клетки, которые были успешно трансформированы ДНК, содержат маркерный ген, а нетрансформированные — нет. Выращивая клетки в присутствии антибиотика или химического вещества, которое отбирает или маркирует клетки, экспрессирующие этот ген, можно отделить модифицированные клетки от немодифицированных. Другой метод скрининга включает использование зонда ДНК , который прикрепляется только к вставленному гену. Эти маркеры обычно присутствуют в трансгенном организме, хотя был разработан ряд стратегий, позволяющих удалить селектируемый маркер из зрелого трансгенного растения. [48]

Подтверждение

[ редактировать ]

Обнаружения того, что рекомбинантный организм содержит встроенные гены, обычно недостаточно для того, чтобы гарантировать, что они будут надлежащим образом экспрессироваться в намеченных тканях. Дальнейшее тестирование с использованием ПЦР, Саузерн-гибридизации и секвенирования ДНК проводится для подтверждения того, что организм содержит новый ген. [49] Эти тесты также могут подтвердить хромосомное расположение и количество копий вставленного гена. После подтверждения методы поиска и измерения генных продуктов (РНК и белка) также используются для оценки экспрессии генов, транскрипции, закономерностей процессинга РНК, а также экспрессии и локализации белковых продуктов. К ним относятся нозерн-гибридизация , количественная ОТ-ПЦР , вестерн-блоттинг , иммунофлуоресценция , ИФА и фенотипический анализ. [50] При необходимости потомство организма изучается, чтобы подтвердить, что трансген и связанный с ним фенотип стабильно наследуются.

Нацеливание на вставку гена

[ редактировать ]
Основные статьи: Нацеливание на гены и редактирование генома

Традиционные методы генной инженерии обычно вводят новый генетический материал в геном хозяина случайным образом. Это может повредить или изменить другие гены в организме. Были разработаны методы, позволяющие вставлять новый генетический материал в определенные участки генома организма. Ранние методы, нацеленные на гены в определенных участках генома, основывались на гомологичной рекомбинации (HR). [51] Создавая конструкции ДНК, содержащие матрицу, соответствующую целевой последовательности генома, возможно, что процессы HR внутри клетки вставят конструкцию в нужное место. Использование этого метода на эмбриональных стволовых клетках привело к созданию трансгенных мышей с целевым нокаутом . Также стало возможным вмешиваться в гены или изменять закономерности экспрессии генов . [52]

Если жизненно важный ген выбит, это может оказаться смертельным для организма. Для изучения функции этих генов сайт-специфические рекомбиназы использовали (SSR). Двумя наиболее распространенными типами являются системы Cre-LoxP и Flp-FRT . Cre-рекомбиназа — это фермент, который удаляет ДНК путем гомологичной рекомбинации между связывающими последовательностями, известными как сайты Lox-P. Система Flip-FRT работает аналогичным образом: рекомбиназа Flip распознает последовательности FRT. Скрещивая организм, содержащий сайты рекомбиназы, фланкирующие интересующий ген, с организмом, который экспрессирует SSR под контролем тканеспецифичных промоторов , можно нокаутировать или включать гены только в определенных клетках. Это также использовалось для удаления маркерных генов у трансгенных животных. Дальнейшие модификации этих систем позволили исследователям вызывать рекомбинацию только при определенных условиях, позволяя генам выключаться или экспрессироваться в желаемое время или на желаемых стадиях развития . [52]

При редактировании генома используются искусственно созданные нуклеазы , которые создают специфические двухцепочечные разрывы в нужных местах генома. Разрывы подвержены процессам репарации клеточной ДНК , которые можно использовать для целенаправленного выключения, коррекции или вставки генов на высоких частотах. Если присутствует донорская ДНК, содержащая соответствующую последовательность (гомологию), то новый генетический материал, содержащий трансген, будет интегрирован в целевой сайт с высокой эффективностью путем гомологичной рекомбинации . [53] Существует четыре семейства инженерных нуклеаз: мегануклеазы , [54] [55] ЗФН , [56] [57] эффекторные нуклеазы, подобные активатору транскрипции (TALEN), [58] [59] CRISPR /Cas (кластеризованные короткие палиндромные повторы с регулярными интервалами/CRISPR-ассоциированный белок (например, CRISPR/Cas9) . [60] [61] Среди четырех типов наиболее часто используются TALEN и CRISPR/Cas. [62] Недавние достижения были направлены на объединение нескольких систем для использования лучших свойств обеих (например, megaTAL, который представляет собой слияние ДНК-связывающего домена TALE и мегануклеазы). [63] Недавние исследования также были сосредоточены на разработке стратегий, позволяющих нокаутировать или корректировать гены без создания двухцепочечных разрывов (редакторы баз). [62]

Мегануклеазы и нуклеазы цинковых пальцев.

[ редактировать ]

Мегануклеазы были впервые использованы в 1988 году в клетках млекопитающих. [64] Мегануклеазы представляют собой эндодезоксирибонуклеазы , которые действуют как ферменты рестрикции с длинными сайтами узнавания, что делает их более специфичными в отношении целевого сайта, чем другие ферменты рестрикции . Это увеличивает их специфичность и снижает токсичность, поскольку они не воздействуют на большое количество сайтов в геноме. Наиболее изученными мегануклеазами являются семейство LAGLIDADG . Хотя мегануклеазы все еще весьма восприимчивы к нецелевому связыванию, что делает их менее привлекательными, чем другие инструменты редактирования генов, их меньший размер по-прежнему делает их привлекательными, особенно с точки зрения вирусной векторизации. [65] [53]

Нуклеазы цинковых пальцев (ZFN), впервые использованные в 1996 году, обычно создаются путем слияния доменов цинковых пальцев и нуклеазного домена Fok I. Таким образом, ZFN обладают способностью расщеплять ДНК в целевых сайтах. [53] Спроектировав домен цинкового пальца, нацеленный на определенный участок генома, можно редактировать геномную последовательность в нужном месте . [65] [66] [53] ZFN обладают большей специфичностью, но все же обладают потенциалом связываться с неспецифическими последовательностями. Хотя определенное количество нецелевого расщепления приемлемо для создания трансгенных модельных организмов, они могут не быть оптимальными для всех методов генной терапии человека. [65]

ТАЛЕН и CRISPR

[ редактировать ]

Доступ к коду, управляющему распознаванием ДНК эффекторами, подобными активаторам транскрипции (TALE), в 2009 году открыл путь к разработке нового класса эффективных инструментов редактирования генов на основе TAL. TALE, белки, секретируемые растительным патогеном Xanthomonas, с высокой специфичностью связываются с генами растения-хозяина и инициируют транскрипцию генов, способствующих заражению. Разработка TALE путем слияния ядра связывания ДНК с каталитическим доменом нуклеазы Fok I позволила создать новый инструмент дизайнерских нуклеаз - нуклеазу TALE (TALEN). [67] Они обладают одной из величайших специфичностей среди всех современных сконструированных нуклеаз. Из-за наличия повторяющихся последовательностей их трудно построить с помощью стандартных процедур молекулярной биологии, и они основаны на более сложных методах, таких как клонирование Золотых ворот . [62]

В 2011 году была разработана еще одна крупная революционная технология, основанная на системах CRISPR/Cas (кластеризованные короткие палиндромные повторы с регулярными интервалами / CRISPR-ассоциированный белок), которые функционируют как адаптивная иммунная система у бактерий и архей . Система CRISPR/Cas позволяет бактериям и археям бороться с вторгшимися вирусами, расщепляя вирусную ДНК и вставляя фрагменты этой ДНК в свой собственный геном. Затем организм транскрибирует эту ДНК в РНК и объединяет эту РНК с белками Cas9 , создавая двухцепочечные разрывы во вторгшейся вирусной ДНК. РНК служит направляющей РНК, направляя фермент Cas9 в нужное место в ДНК вируса. Соединяя белки Cas с разработанной направляющей РНК, CRISPR/Cas9 можно использовать для индукции двухцепочечных разрывов в определенных точках последовательностей ДНК. Разрыв восстанавливается ферментами репарации клеточной ДНК, что в большинстве случаев создает небольшую мутацию типа вставки/делеции. Направленная репарация ДНК возможна путем предоставления матрицы донорской ДНК, которая представляет желаемое изменение и которая (иногда) используется для репарации двухцепочечных разрывов путем гомологичной рекомбинации. Позже было продемонстрировано, что CRISPR/Cas9 может редактировать человеческие клетки в чашке. Хотя раннему поколению не хватает особенностей TALEN, основным преимуществом этой технологии является простота конструкции. Это также позволяет одновременно воздействовать на несколько сайтов, позволяя редактировать несколько генов одновременно. CRISPR/Cpf1 — это недавно открытая система, которая требует другой направляющей РНК для создания особых двухцепочечных разрывов (оставляет выступы при расщеплении ДНК) по сравнению с CRISPR/Cas9. [62]

CRISPR/Cas9 эффективен при разрушении генов. Создание китайским исследователем Хэ Цзянькуем детей, устойчивых к ВИЧ, является, пожалуй, самым известным примером разрушения генов с помощью этого метода. [68] Он гораздо менее эффективен при коррекции генов. В настоящее время разрабатываются методы редактирования оснований, в которых для нацеливания на ген используется «мертвая по нуклеазе» эндонуклеаза Cas 9 или родственный ей фермент, в то время как связанный фермент деаминаза производит целевое изменение оснований в ДНК. [69] Самая последняя модификация CRISPR-Cas9 называется Prime Editing. Этот метод связывает обратную транскриптазу с сконструированной нуклеазой, управляемой РНК, которая делает только одноцепочечные разрезы, но не разрывает двухцепочечные. Он заменяет часть ДНК рядом с разрезом путем последовательного действия нуклеазы и обратной транскриптазы, внося желаемое изменение в матрицу РНК. [70]

См. также

[ редактировать ]

Ссылки

[ редактировать ]
  1. ^ Корень С (2007). Одомашнивание . Издательские группы Гринвуда. ISBN  9780313339875 .
  2. ^ Перейти обратно: а б Кингсбери Н. (15 октября 2009 г.). Гибрид: История и наука селекции растений . Издательство Чикагского университета. ISBN  978-0-226-43705-7 .
  3. ^ Хартл Д.Л., Орел V (июнь 1992 г.). «Что, по мнению Грегора Менделя, он открыл?» . Генетика . 131 (2): 245–53. дои : 10.1093/генетика/131.2.245 . ПМК   1205000 . ПМИД   1644269 .
  4. ^ Робертс Р.Дж. (апрель 2005 г.). «Как ферменты рестрикции стали рабочими лошадками молекулярной биологии» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 102 (17): 5905–8. Бибкод : 2005PNAS..102.5905R . дои : 10.1073/pnas.0500923102 . ПМЦ   1087929 . ПМИД   15840723 .
  5. ^ Вайс Б., Ричардсон CC (апрель 1967 г.). «Ферментативный разрыв и присоединение дезоксирибонуклеиновой кислоты. I. Репарация одноцепочечных разрывов ДНК ферментной системой Escherichia coli, инфицированной бактериофагом Т4» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 57 (4): 1021–8. Бибкод : 1967PNAS...57.1021W . дои : 10.1073/pnas.57.4.1021 . ПМК   224649 . ПМИД   5340583 .
  6. ^ Ледерберг Дж. (октябрь 1952 г.). «Клеточная генетика и наследственный симбиоз». Физиологические обзоры . 32 (4): 403–30. CiteSeerX   10.1.1.458.985 . дои : 10.1152/physrev.1952.32.4.403 . ПМИД   13003535 .
  7. ^ Мандель М., Хига А. (октябрь 1970 г.). «Кальций-зависимая ДНК-инфекция бактериофага». Журнал молекулярной биологии . 53 (1): 159–62. дои : 10.1016/0022-2836(70)90051-3 . ПМИД   4922220 .
  8. ^ Вирт Р., Фризенеггер А., Фидлер С. (март 1989 г.). «Трансформация различных видов грамотрицательных бактерий, принадлежащих к 11 различным родам, методом электропорации». Молекулярная и общая генетика . 216 (1): 175–7. дои : 10.1007/BF00332248 . ПМИД   2659971 . S2CID   25214157 .
  9. ^ Нестер, Евгений. «Агробактерия: природный генный инженер (100 лет спустя)» . Архивировано из оригинала 19 октября 2012 года . Проверено 14 января 2011 г.
  10. ^ Замбриски П., Йоос Х., Дженетелло С., Лиманс Дж., Монтегю М.В., Шелл Дж. (1983). «Ти-плазмидный вектор для введения ДНК в растительные клетки без изменения их нормальной регенерационной способности» . Журнал ЭМБО . 2 (12): 2143–50. дои : 10.1002/j.1460-2075.1983.tb01715.x . ПМК   555426 . ПМИД   16453482 .
  11. ^ «Открытие биологии заново — онлайн-учебник: Раздел 13: Генетически модифицированные организмы» . www.learner.org . Архивировано из оригинала 3 декабря 2019 г. Проверено 18 августа 2017 г.
  12. ^ Перейти обратно: а б с Альбертс Б., Джонсон А., Льюис Дж., Рафф М., Робертс К., Уолтер П. (2002). «Изучение экспрессии и функции генов» . Молекулярная биология клетки . Нью-Йорк: Garland Science.
  13. ^ Гриффитс А.Дж., Миллер Дж.Х., Сузуки Д.Т., Левонтин Р.К., Гелбарт В.М. (2000). «Типы-мутанты» . Введение в генетический анализ (7-е изд.).
  14. ^ Ко Х.Дж., Квон С.Ю., Томсон М. (26 августа 2015 г.). Современные технологии в молекулярной селекции растений: Путеводитель по молекулярной селекции растений для исследователей . Спрингер. п. 242. ИСБН  9789401799966 .
  15. ^ Ро JY, Чхве JY, Ли М.С., Джин БР, Дже ЮХ (апрель 2007 г.). «Bacillus thuringiensis как специфическое, безопасное и эффективное средство борьбы с насекомыми-вредителями». Журнал микробиологии и биотехнологии . 17 (4): 547–59. ПМИД   18051264 .
  16. ^ Адлер Дж. (май 2011 г.). «Растущая угроза со стороны суперсорняков». Научный американец . 304 (5): 74–9. Бибкод : 2011SciAm.304e..74A . doi : 10.1038/scientificamerican0511-74 . ПМИД   21595408 .
  17. ^ Продовольственная и сельскохозяйственная организация Объединенных Наций. «Процесс генетической модификации» .
  18. ^ Перейти обратно: а б Николл С.Т. (29 мая 2008 г.). Введение в генную инженерию . Издательство Кембриджского университета. ISBN  978-1-139-47178-7 .
  19. ^ Михелс, Калифорния (10 июня 2002 г.). Генетические методы биологических исследований: подход к тематическому исследованию . Джон Уайли и сыновья. стр. 85–88. ISBN  978-0-471-89919-8 .
  20. ^ Альбертс Б. и др. (2002). «8» . Выделение, клонирование и секвенирование ДНК (4-е изд.). Нью-Йорк: Garland Science.
  21. ^ Кауфман Р.И., Никсон Б.Т. (июль 1996 г.). «Использование ПЦР для выделения генов, кодирующих сигма54-зависимые активаторы, из различных бактерий» . Журнал бактериологии . 178 (13): 3967–70. дои : 10.1128/jb.178.13.3967-3970.1996 . ПМК   232662 . ПМИД   8682806 .
  22. ^ Лян Дж, Ло Ю, Чжао Х (2011). «Синтетическая биология: введение синтеза в биологию» . Междисциплинарные обзоры Wiley: системная биология и медицина . 3 (1): 7–20. дои : 10.1002/wsbm.104 . ПМК   3057768 . ПМИД   21064036 .
  23. ^ «ГенеАрт Синтез генов» . www.thermofisher.com . Проверено 9 ноября 2017 г.
  24. ^ Берг П., Мерц Дж.Э. (январь 2010 г.). «Личные размышления о происхождении и появлении технологии рекомбинантной ДНК» . Генетика . 184 (1): 9–17. дои : 10.1534/genetics.109.112144 . ПМЦ   2815933 . ПМИД   20061565 .
  25. ^ Найероссадат Н., Маеде Т., Али П.А. (6 июля 2012 г.). «Вирусные и невирусные системы доставки генов» . Передовые биомедицинские исследования . 1:27 . дои : 10.4103/2277-9175.98152 . ПМК   3507026 . ПМИД   23210086 .
  26. ^ Перейти обратно: а б Чен И, Дубнау Д (март 2004 г.). «Поглощение ДНК во время бактериальной трансформации». Обзоры природы. Микробиология . 2 (3): 241–9. дои : 10.1038/nrmicro844 . ПМИД   15083159 . S2CID   205499369 .
  27. ^ Перейти обратно: а б Комитет Национального исследовательского совета (США) по выявлению и оценке непреднамеренного воздействия генно-инженерных продуктов на здоровье человека (01.01.2004). Методы и механизмы генетического манипулирования растениями, животными и микроорганизмами . Издательство национальных академий (США).
  28. ^ Гельвин С.Б. (март 2003 г.). «Трансформация растений с помощью агробактерий: биология, лежащая в основе инструмента «генной игры»» . Обзоры микробиологии и молекулярной биологии . 67 (1): 16–37, оглавление. дои : 10.1128/ММБР.67.1.16-37.2003 . ПМК   150518 . ПМИД   12626681 .
  29. ^ Фрэнсис К.Э., Спайкер С. (февраль 2005 г.). «Идентификация трансформантов Arabidopsis thaliana без отбора показывает высокую частоту подавленных интеграций Т-ДНК» . Заводской журнал . 41 (3): 464–77. дои : 10.1111/j.1365-313x.2004.02312.x . ПМИД   15659104 .
  30. ^ Шелл Дж., Ван Монтегю М. (1977). «Ти-плазмида Agrobacterium Tumefaciens, природный вектор для введения генов NIF в растения?». В: Холлаендер А., Беррис Р.Х., Дэй П.Р., Харди Р.В., Хелински Д.Р., Ламборг М.Р., Оуэнс Л., Валентайн Р.К. (ред.). Генная инженерия для фиксации азота . Фундаментальные науки о жизни. Том. 9. стр. 159–79. дои : 10.1007/978-1-4684-0880-5_12 . ISBN  978-1-4684-0882-9 . ПМИД   336023 .
  31. ^ Йоос Х, Тиммерман Б, Монтегю М.В., Шелл Дж (1983). «Генетический анализ переноса и стабилизации ДНК агробактерий в растительных клетках» . Журнал ЭМБО . 2 (12): 2151–60. дои : 10.1002/j.1460-2075.1983.tb01716.x . ПМК   555427 . ПМИД   16453483 .
  32. ^ Томсон Дж.А. «Генная инженерия растений» (PDF) . Биотехнология . 3 . Проверено 17 июля 2016 г.
  33. ^ Лойцингер К., Дент М., Уртадо Дж., Станке Дж., Лай Х., Чжоу X, Чен Q (июль 2013 г.). «Эффективная агроинфильтрация растений для высокого уровня транзиторной экспрессии рекомбинантных белков» . Журнал визуализированных экспериментов . 77 (77). дои : 10.3791/50521 . ПМЦ   3846102 . ПМИД   23913006 .
  34. ^ Руководитель G, Халл Р.Х., Цотзос Г.Т. (2009 г.). Генетически модифицированные растения: оценка безопасности и управление рисками . Лондон: Академический проф. п. 244 . ISBN  978-0-12-374106-6 .
  35. ^ Альбертс Б. , Джонсон А., Льюис Дж., Рафф М., Робертс К., Уолтер П. (2002). Молекулярная биология клетки . Нью-Йорк: Garland Science. п. Г:35. ISBN  978-0-8153-4072-0 .
  36. ^ Перейти обратно: а б Камимура К., Суда Т., Чжан Г., Лю Д. (октябрь 2011 г.). «Достижения в области систем доставки генов» . Фармацевтическая медицина . 25 (5): 293–306. дои : 10.1007/bf03256872 . ПМЦ   3245684 . ПМИД   22200988 .
  37. ^ Пак Д.В., Хоффман А.С., Пан С., Стейтон П.С. (июль 2005 г.). «Проектирование и разработка полимеров для доставки генов». Обзоры природы. Открытие наркотиков . 4 (7): 581–93. дои : 10.1038/nrd1775 . ПМИД   16052241 . S2CID   20972049 .
  38. ^ «Лекция 8 Генная инженерия клеток животных» . www.slideshare.net . 25 января 2012 г. Проверено 18 июля 2018 г.
  39. ^ Биоциклопедия.com. «Методы переноса генов (трансфекции) у животных | Генная инженерия и биотехнология. Методы переноса генов и трансгенные организмы | Генетика, биотехнология, молекулярная биология, ботаника | Biocyclepedia.com» . биоциклопедия.com . Проверено 18 июля 2018 г.
  40. ^ Ким, Тэ Гён; Эбервин, Джеймс Х. (август 2010 г.). «Трансфекция клеток млекопитающих: настоящее и будущее» . Аналитическая и биоаналитическая химия . 397 (8): 3173–3178. дои : 10.1007/s00216-010-3821-6 . ISSN   1618-2642 . ПМЦ   2911531 . ПМИД   20549496 .
  41. ^ Маллин А. «Пронуклеарная инъекция» . Тулейнский университет. Архивировано из оригинала 9 августа 2016 г. Проверено 19 июля 2018 г.
  42. ^ «Перенос генов, опосредованный эмбриональными стволовыми клетками - трансгенные животные» . сайты.google.com . Проверено 19 июля 2018 г.
  43. ^ Трансдукция, генетика , Национальная медицинская библиотека США по медицинским предметным рубрикам (MeSH).
  44. ^ «Перенаправление стволовых клеток» . Stemcells.nih.gov . Архивировано из оригинала 20 января 2017 г. Проверено 6 июля 2016 г.
  45. ^ Туомела М., Станеску И., Крон К. (октябрь 2005 г.). «Обзор валидации биоаналитических методов». Генная терапия . 12 Приложение 1 (S1): S131–8. дои : 10.1038/sj.gt.3302627 . ПМИД   16231045 .
  46. ^ Нараянасвами С. (1994). Культура растительных клеток и тканей . Тата МакГроу-Хилл Образование. стр. VI. ISBN  9780074602775 .
  47. ^ Уолтер, Питер; Робертс, Кейт; Рафф, Мартин; Льюис, Джулиан; Джонсон, Александр; Альбертс, Брюс (2002). «Изучение экспрессии и функции генов» . Молекулярная биология клетки. 4-е издание .
  48. ^ Хон Б., Леви А.А., Пухта Х (апрель 2001 г.). «Устранение маркеров селекции из трансгенных растений». Современное мнение в области биотехнологии . 12 (2): 139–43. дои : 10.1016/S0958-1669(00)00188-9 . ПМИД   11287227 .
  49. ^ Сетлоу Дж. К. (31 октября 2002 г.). Генная инженерия: принципы и методы . Springer Science & Business Media. п. 109. ИСБН  9780306472800 .
  50. ^ Дипак С., Коттапалли К., Раквал Р., Орос Г., Рангаппа К., Ивахаши Х., Масуо Ю., Агравал Г. (июнь 2007 г.). «ПЦР в реальном времени: революция в обнаружении и анализе экспрессии генов» . Современная геномика . 8 (4): 234–51. дои : 10.2174/138920207781386960 . ПМК   2430684 . ПМИД   18645596 .
  51. ^ Лодиш Х., Берк А., Зипурски С.Л., Мацудайра П., Балтимор Д., Дарнелл Дж. (2000). «Глава 8.5: Замена генов и трансгенные животные: ДНК переносится в эукариотические клетки различными способами». Молекулярно-клеточная биология (4-е изд.). WH Фриман и компания. ISBN  978-0-7167-3136-8 .
  52. ^ Перейти обратно: а б Роча-Мартинс, Маурисио; Кавальейру, Габриэль Р.; Матос-Родригес, Габриэль Э.; Мартинс, Родриго А. П.; Роча-Мартинс, Маурисио; Кавальейру, Габриэль Р.; Матос-Родригес, Габриэль Э.; Мартинс, Родриго А. П. (август 2015 г.). «От нацеливания на гены к редактированию генома: применение трансгенных животных и не только» . Анналы Бразильской академии наук . 87 (2): 1323–1348. дои : 10.1590/0001-3765201520140710 . ISSN   0001-3765 . ПМИД   26397828 .
  53. ^ Перейти обратно: а б с д Кэрролл Д. (август 2011 г.). «Геномная инженерия с помощью нуклеаз с цинковыми пальцами» . Генетика . 188 (4): 773–82. дои : 10.1534/genetics.111.131433 . ПМК   3176093 . ПМИД   21828278 .
  54. ^ Гризо С., Смит Дж., Дабусси Ф., Прието Дж., Редондо П., Мерино Н., Виллате М., Томас С., Лемэр Л., Монтойя Дж., Бланко Ф.Дж., Пакес Ф., Дюшато П. (сентябрь 2009 г.). «Эффективное нацеливание на ген SCID с помощью сконструированной одноцепочечной эндонуклеазы самонаведения» . Исследования нуклеиновых кислот . 37 (16): 5405–19. дои : 10.1093/нар/gkp548 . ПМЦ   2760784 . ПМИД   19584299 .
  55. ^ Гао Х., Смит Дж., Ян М., Джонс С., Джуканович В., Николсон М.Г., Вест А., Бидни Д., Фалько С.С., Янц Д., Лызник Л.А. (январь 2010 г.). «Наследственный целевой мутагенез кукурузы с использованием разработанной эндонуклеазы». Заводской журнал . 61 (1): 176–87. дои : 10.1111/j.1365-313X.2009.04041.x . ПМИД   19811621 .
  56. ^ Таунсенд Дж.А., Райт Д.А., Уинфри Р.Дж., Фу Ф., Мэдер М.Л., Йонг Дж.К., Войтас Д.Ф. (май 2009 г.). «Высокочастотная модификация генов растений с использованием сконструированных нуклеаз с цинковыми пальцами» . Природа . 459 (7245): 442–5. Бибкод : 2009Natur.459..442T . дои : 10.1038/nature07845 . ПМЦ   2743854 . ПМИД   19404258 .
  57. ^ Шукла В.К., Дойон Ю., Миллер Дж.К., ДеКелвер Р.К., Мёле Э.А., Уорден С.Э., Митчелл Дж.С., Арнольд Н.Л., Гопалан С., Мэн Х, Чой В.М., Рок Дж.М., Ву Ю., Катиба Г.Е., Чжифан Г., Маккаскилл Д., Симпсон М.А. , Блейксли Б., Гринвалт С.А., Батлер Х.Дж., Хинкли С.Дж., Чжан Л., Ребар Э.Дж., Грегори П.Д., Урнов Ф.Д. (май 2009 г.). «Точная модификация генома сельскохозяйственных культур Zea mays с использованием нуклеаз с цинковыми пальцами». Природа . 459 (7245): 437–41. Бибкод : 2009Natur.459..437S . дои : 10.1038/nature07992 . ПМИД   19404259 . S2CID   4323298 .
  58. ^ Кристиан М., Чермак Т., Дойл Э.Л., Шмидт С., Чжан Ф., Хаммел А., Богданове А.Дж., Войтас Д.Ф. (октябрь 2010 г.). «Нацеливание на двухцепочечные разрывы ДНК с помощью эффекторных нуклеаз TAL» . Генетика . 186 (2): 757–61. дои : 10.1534/genetics.110.120717 . ПМЦ   2942870 . ПМИД   20660643 .
  59. ^ Ли Т., Хуан С., Цзян В.З., Райт Д., Сполдинг М.Х., Уикс Д.П., Ян Б. (январь 2011 г.). «Нуклеазы TAL (TALN): гибридные белки, состоящие из эффекторов TAL и домена расщепления ДНК FokI» . Исследования нуклеиновых кислот . 39 (1): 359–72. дои : 10.1093/nar/gkq704 . ПМК   3017587 . ПМИД   20699274 .
  60. ^ Эсвелт К.М., Ван Х.Х. (2013). «Геномная инженерия для системной и синтетической биологии» . Молекулярная системная биология . 9 : 641. дои : 10.1038/msb.2012.66 . ПМЦ   3564264 . ПМИД   23340847 .
  61. ^ Тан В.С., Карлсон Д.Ф., Уолтон М.В., Фаренкруг СК, Хакетт П.Б. (2012). «Точное редактирование геномов крупных животных». Достижения в области генетики, том 80 . Том. 80. стр. 37–97. дои : 10.1016/B978-0-12-404742-6.00002-8 . ISBN  9780124047426 . ПМЦ   3683964 . ПМИД   23084873 .
  62. ^ Перейти обратно: а б с д Мальзан, Эйми; Лоудер, Леви; Ци, Ипин (2017). «Редактирование генома растений с помощью TALEN и CRISPR» . Клетка и биологические науки . 7:21 . дои : 10.1186/s13578-017-0148-4 . ПМЦ   5404292 . ПМИД   28451378 .
  63. ^ Буассель С., Жарджур Дж., Астрахан А., Адей А., Губль А., Дюшато П., Шендюр Дж., Стоддард Б.Л., Черто М.Т., Бейкер Д., Шаренберг А.М. (февраль 2014 г.). «megaTALs: архитектура нуклеаз редкого расщепления для терапевтической геномной инженерии» . Исследования нуклеиновых кислот . 42 (4): 2591–601. дои : 10.1093/нар/gkt1224 . ПМЦ   3936731 . ПМИД   24285304 .
  64. ^ Чулика, А.; Перрин, А.; Дюжон, Б.; Николас, Дж. Ф. (1994). «Мегануклеаза дрожжей I-Sce I индуцирует сайт-направленную хромосомную рекомбинацию в клетках млекопитающих». Comptes Rendus de l'Académie des Sciences, Série III . 317 (11): 1013–9. ПМИД   7882137 .
  65. ^ Перейти обратно: а б с Сильва Дж., Пуаро Л., Галетто Р., Смит Дж., Монтойя Дж., Дюшато П., Пак Ф. (февраль 2011 г.). «Мегануклеазы и другие инструменты целевой геномной инженерии: перспективы и проблемы генной терапии» . Современная генная терапия . 11 (1): 11–27. дои : 10.2174/156652311794520111 . ПМК   3267165 . ПМИД   21182466 .
  66. ^ Сильва Г.Х., Белфорт М., Венде В., Пингуд А. (август 2006 г.). «От мономерных к гомодимерным эндонуклеазам и обратно: разработка новой специфичности ферментов LAGLIDADG». Журнал молекулярной биологии . 361 (4): 744–54. дои : 10.1016/j.jmb.2006.06.063 . ПМИД   16872628 .
  67. ^ Кристиан, М.; Чермак, Т.; Дойл, Эл.; Шмидт, К.; Чжан, Ф.; Хаммель, А.; Богданов, AJ; Войтас, Д.Ф. (2010). «Нацеливание на двухцепочечные разрывы ДНК с помощью эффекторных нуклеаз TAL» . Генетика . 186 (2): 757–761. дои : 10.1534/genetics.110.120717 . ПМЦ   2942870 . ПМИД   20660643 .
  68. ^ Сираноски, Д. (2019). «Что будет дальше с детьми, использующими CRISPR?» . Природа . 566 (7745): 440–442. дои : 10.1038/d41586-019-00673-1 . ПМИД   30809070 .
  69. ^ Рис, Х.; Лю, ДР (2018). «Базовое редактирование: прецизионная химия генома и транскриптома живых клеток» . Обзоры природы Генетика . 19 (12): 770–788. дои : 10.1038/s41576-018-0059-1 . ПМК   6535181 . ПМИД   30323312 .
  70. ^ Анзалоне, А.В.; Рэндольф, ПБ; Дэвис, младший (2019). «Редактирование генома с поиском и заменой без разрывов двойной цепи или донорской ДНК» . Природа . 576 (7785): 149–157. Бибкод : 2019Natur.576..149A . дои : 10.1038/s41586-019-1711-4 . ПМК   6907074 . ПМИД   31634902 .
Retrieved from "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Genetic_engineering_techniques&oldid=1225571014"
Arc.Ask3.Ru: конец переведенного документа.
Arc.Ask3.Ru
Номер скриншота №: a06c54b1d669c69b2180fa5bcd7ce9eb__1716618180
URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/a0/eb/a06c54b1d669c69b2180fa5bcd7ce9eb.html
Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1:
Genetic engineering techniques - Wikipedia
Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)