Нозерн-блот
Нозерн -блоттинг , или РНК-блоттинг. [1] — это метод, используемый в в области молекулярной биологии исследованиях для изучения экспрессии генов путем обнаружения РНК (или изолированной мРНК ) в образце. [2] [3]
С помощью нозерн-блоттинга можно наблюдать клеточный контроль над структурой и функцией путем определения конкретной скорости экспрессии генов во время дифференцировки и морфогенеза , а также в аномальных или болезненных состояниях. [4] Нозерн-блоттинг включает использование электрофореза для разделения образцов РНК по размеру и обнаружение с помощью гибридизационного зонда, комплементарного части или всей целевой последовательности. Строго говоря, термин «нозерн-блоттинг» относится конкретно к капиллярному переносу РНК из геля для электрофореза на мембрану для блоттинга. Однако весь процесс обычно называют нозерн-блоттингом. [5] Техника нозерн-блоттинга была разработана в 1977 году Джеймсом Алвайном, Дэвидом Кемпом и Джорджем Старком в Стэнфордском университете . [6] Нозерн-блоттинг получил свое название от сходства с первым методом блоттинга, Саузерн-блоттингом , названным в честь биолога Эдвина Сазерна . [2] Основное отличие состоит в том, что РНК, а не ДНК . при нозерн-блоттинге анализируется [7]
Процедура
[ редактировать ]Общая процедура блоттинга [5] начинается с экстракции тотальной РНК из гомогенизированного образца ткани или из клеток. Затем мРНК эукариот можно выделить с помощью хроматографии на олиго (dT) целлюлозе , чтобы выделить только те РНК, которые имеют поли(А)-хвост . [8] [9] Затем образцы РНК разделяют с помощью гель-электрофореза. Поскольку гели хрупкие и зонды не могут проникнуть в матрицу, образцы РНК, теперь разделенные по размеру, переносятся на нейлоновую мембрану через капиллярную или вакуумную систему блоттинга.
Нейлоновая мембрана с положительным зарядом наиболее эффективна для использования в нозерн-блоттинге, поскольку отрицательно заряженные нуклеиновые кислоты обладают высоким сродством к ним. Буфер для переноса, используемый для блоттинга, обычно содержит формамид , поскольку он снижает температуру отжига взаимодействия зонд-РНК, тем самым устраняя необходимость в высоких температурах, которые могут вызвать деградацию РНК. [10] Как только РНК переносится на мембрану, она иммобилизуется посредством ковалентной связи с мембраной под действием УФ-света или тепла. После того как зонд помечен, он гибридизуется с РНК на мембране. Экспериментальные условия, которые могут повлиять на эффективность и специфичность гибридизации, включают ионную силу, вязкость, длину дуплекса, несовпадающие пары оснований и состав оснований. [11] Мембрану промывают, чтобы гарантировать специфическое связывание зонда и предотвратить возникновение фоновых сигналов. Гибридные сигналы затем обнаруживаются с помощью рентгеновской пленки и могут быть определены количественно с помощью денситометрии . Чтобы создать контрольные образцы для сравнения в нозерн-блоттинге, можно использовать образцы, не показывающие интересующий генный продукт, после определения с помощью микрочипов или RT-PCR . [11]
Гели
[ редактировать ]
Образцы РНК чаще всего разделяют на агарозных гелях, содержащих формальдегид в качестве денатурирующего агента, ограничивающего вторичную структуру РНК. [11] [12] Гели можно окрасить бромидом этидия (EtBr) и просмотреть в УФ-свете, чтобы оценить качество и количество РНК перед блоттингом. [11] в полиакриламидном Электрофорез геле с мочевиной также можно использовать для разделения РНК, но чаще всего его используют для фрагментированных РНК или микроРНК. [13] Рядом с образцами на геле для электрофореза часто проводят лестницу РНК, чтобы наблюдать за размером полученных фрагментов, но в образцах тотальной РНК субъединицы рибосом могут действовать как маркеры размера. [11] Поскольку большая субъединица рибосомы имеет размер 28S (приблизительно 5 т.п.н.), а малая субъединица рибосомы - 18S (приблизительно 2 т.п.н.), на геле появляются две заметные полосы, причем интенсивность большей почти в два раза превышает интенсивность меньшей. [11] [14]
Зонды
[ редактировать ]Зонды для нозерн-блоттинга состоят из нуклеиновых кислот с последовательностью, комплементарной всей или части интересующей РНК. Это могут быть ДНК, РНК или олигонуклеотиды, содержащие минимум 25 оснований, комплементарных целевой последовательности. [5] Зонды РНК (рибозонды), которые транскрибируются in vitro, способны выдерживать более строгие этапы промывки, предотвращая часть фонового шума. [11] Обычно кДНК создается с помощью меченых праймеров для интересующей последовательности РНК, которые действуют как зонд в нозерн-блоттинге. [15] Зонды должны быть помечены либо радиоактивными изотопами ( 32 P) или с хемилюминесценцией , при которой щелочная фосфатаза или пероксидаза хрена (HRP) расщепляют хемилюминесцентные субстраты, вызывая заметное излучение света. [16] Хемилюминесцентное мечение может происходить двумя способами: либо зонд присоединяется к ферменту, либо зонд метится лигандом (например, биотином ), при котором лиганд (например, авидин или стрептавидин ) присоединяется к ферменту (например, HRP). . [11] Рентгеновская пленка может обнаруживать как радиоактивные, так и хемилюминесцентные сигналы, и многие исследователи предпочитают хемилюминесцентные сигналы, потому что они быстрее, более чувствительны и уменьшают опасность для здоровья, связанную с радиоактивными метками. [16] Одну и ту же мембрану можно зондировать до пяти раз без значительной потери целевой РНК. [10]
Приложения
[ редактировать ]Нозерн-блоттинг позволяет наблюдать характер экспрессии определенного гена в тканях, органах, стадиях развития, уровнях экологического стресса, инфекции патогенов и в течение курса лечения. [9] [15] [17] Этот метод использовался, чтобы показать сверхэкспрессию онкогенов и подавление генов-супрессоров опухолей в раковых клетках по сравнению с «нормальными» тканями. [11] а также экспрессия генов при отторжении трансплантированных органов. [18] Если при нозерн-блоттинге обнаруживается повышенная экспрессия гена по обилию мРНК, образец можно затем секвенировать, чтобы определить, известен ли этот ген исследователям или это новое открытие. [18] Паттерны экспрессии, полученные в данных условиях, могут дать представление о функции этого гена. Поскольку РНК сначала разделяется по размеру, если используется только один тип зонда, дисперсия уровня каждой полосы на мембране может дать представление о размере продукта, предполагая альтернативные продукты сплайсинга одного и того же гена или мотивы повторяющейся последовательности. [8] [14] Различия в размере генного продукта также могут указывать на делеции или ошибки в обработке транскриптов. Изменяя зонд-мишень, используемый в известной последовательности, можно определить, какой участок РНК отсутствует. [2]
Преимущества и недостатки
[ редактировать ]Анализ экспрессии генов можно проводить несколькими различными методами, включая RT-PCR, анализы защиты от РНКазы, микрочипы, RNA-Seq , серийный анализ экспрессии генов (SAGE), а также нозерн-блоттинг. [4] [5] Микрочипы используются довольно часто и обычно согласуются с данными, полученными с помощью нозерн-блоттинга; однако иногда нозерн-блоттинг способен обнаружить небольшие изменения в экспрессии генов, чего не могут сделать микрочипы. [19] Преимущество микрочипов перед нозерн-блоттингом заключается в том, что одновременно можно визуализировать тысячи генов, тогда как нозерн-блоттинг обычно рассматривает один или небольшое количество генов. [17] [19]
Проблемой нозерн-блоттинга часто является разложение образца РНКазами (как эндогенными по отношению к образцу, так и загрязнением окружающей среды), чего можно избежать путем надлежащей стерилизации стеклянной посуды и использования ингибиторов РНКазы, таких как DEPC ( диэтилпирокарбонат ). [5] Химические вещества, используемые в большинстве нозерн-блоттингов, могут представлять опасность для исследователя, поскольку формальдегид, радиоактивные материалы, бромид этидия, DEPC и ультрафиолетовый свет при определенных воздействиях вредны. [11] По сравнению с RT-PCR нозерн-блоттинг обладает низкой чувствительностью, но также обладает высокой специфичностью, что важно для снижения ложноположительных результатов. [11]
Преимущества использования нозерн-блоттинга включают определение размера РНК, наблюдение альтернативных продуктов сплайсинга, использование зондов с частичной гомологией, качество и количество РНК можно измерить на геле перед блоттингом, а мембраны можно хранить. и подвергался критике в течение многих лет после блоттинга. [11]
Для нозерн-блоттинга для обнаружения ацетилхолинэстеразы мРНК нерадиоактивный метод сравнивали с радиоактивным методом и обнаружили, что он столь же чувствителен, как и радиоактивный, но не требует защиты от радиации и требует меньше времени. [20]
Обратный нозерн-блот
[ редактировать ]Исследователи иногда используют вариант процедуры, известный как обратный нозерн-блоттинг. В этой процедуре нуклеиновая кислота-субстрат (прикрепленная к мембране) представляет собой набор изолированных фрагментов ДНК, а зонд представляет собой РНК, экстрагированную из ткани и радиоактивно помеченную.Использование ДНК-микрочипов , получивших широкое распространение в конце 1990-х — начале 2000-х годов, больше похоже на обратную процедуру, поскольку предполагает использование изолированных фрагментов ДНК, прикрепленных к субстрату, и гибридизацию с зондом, изготовленным из клеточной РНК. . Таким образом, обратная процедура, хотя изначально и была необычной, позволила северному анализу развиться в профилирование экспрессии генов , при котором можно контролировать экспрессию многих (возможно, всех) генов в организме.
См. также
[ редактировать ]- Вестерн-блоттинг
- Восточное пятно
- Северо-западный блот
- Дальневосточное пятно
- Дальнезападный блот
- Дифференциальный дисплей
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Гилберт, С.Ф. (2000) Биология развития, 6-е изд. Сандерленд, Массачусетс, Sinauer Associates.
- ^ Перейти обратно: а б с Альбертс Б., Джонсон А., Льюис Дж. Рафф М., Робертс К., Уолтер П. 2008. Молекулярная биология клетки, 5-е изд. Garland Science, Taylor & Francisco Group, Нью-Йорк, стр. 538–539.
- ^ Кевил, К.Г., Уолш, Л., Лару, Ф.С., Калогерис, Т., Гришам, М.Б., Александр, Дж.С. (1997) Улучшенный быстрый северный протокол. Биохим. и биофиз. Исследовательский комм. 238:277–279.
- ^ Перейти обратно: а б Шламп, К.; Вайнманн, А.; Крупп, М.; Маасс, Т.; Галле, PR; Тойфель, А. (2008). «BlotBase: база данных нозерн-блоттинга». Джин . 427 (1–2): 47–50. дои : 10.1016/j.gene.2008.08.026 . ПМИД 18838116 .
- ^ Перейти обратно: а б с д и Трейхурн, П. (1996) Нозерн-блоттинг. Про. Соц. питания. 55:583–589.
- ^ Алвин Джей Си, Кемп Диджей, Старк Г. Р. (1977). «Метод обнаружения специфических РНК в агарозных гелях путем переноса на диазобензилоксиметил-бумагу и гибридизации с ДНК-зондами» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 74 (12): 5350–4. Бибкод : 1977PNAS...74.5350A . дои : 10.1073/pnas.74.12.5350 . ПМК 431715 . ПМИД 414220 .
- ^ Бор, ЮК; Шварц, Дж.; Ли, Ю.; Койл, Дж.; Рекош, Д.; Хаммаршельд, Мария-Луиза (2006). «Нозерн-блот-анализ мРНК полирибосом млекопитающих» . Протоколы природы . дои : 10.1038/нпрот.2006.216 .
- ^ Перейти обратно: а б Дюран, генеральный директор; Зукин, Р.С. (1993). «Регуляция развития мРНК, кодирующих каинатные / AMPA-рецепторы мозга крысы: исследование Northern Analysis». Дж. Нейрохем . 61 (6): 2239–2246. дои : 10.1111/j.1471-4159.1993.tb07465.x . ПМИД 8245974 . S2CID 33955961 .
- ^ Перейти обратно: а б Мори, Х.; Такэда-Ёсикава, Ю.; Хара-Нишимура, И.; Нисимура, М. (1991). «Клонирование малатсинтазы тыквы и секвенирование кДНК и нозерн-блот-анализ». Евро. Дж. Биохим . 197 (2): 331–336. дои : 10.1111/j.1432-1033.1991.tb15915.x . ПМИД 1709098 .
- ^ Перейти обратно: а б Ян, Х.; Маклиз, Дж.; Вайсбарт, М.; Дионн, Ж.-Л.; Лемэр, И.; Обин, Р.А. (1993). «Упрощенный протокол высокой пропускной способности для северной гибридизации» . Исследования нуклеиновых кислот . 21 (14): 3337–3338. дои : 10.1093/нар/21.14.3337 . ПМК 309787 . ПМИД 8341618 .
- ^ Перейти обратно: а б с д и ж г час я дж к л Стрейт, С.; Михальски, CW; Эркан, М.; Клиф, Дж.; Фрисс, Х. (2009). «Нозерн-блот-анализ для обнаружения РНК в клетках и тканях рака поджелудочной железы». Протоколы природы . 4 (1): 37–43. дои : 10.1038/nprot.2008.216 . ПМИД 19131955 . S2CID 24980302 .
- ^ Яманака, С.; Поксай, Канзас; Арнольд, Канзас; Иннерарность, TL (1997). «Новая мРНК репрессора трансляции широко редактируется в печени, содержащей опухоли, вызванные трансгенной экспрессией фермента, редактирующего мРНК апоВ» . Генс Дев . 11 (3): 321–333. дои : 10.1101/gad.11.3.321 . ПМИД 9030685 .
- ^ Валоци, А., Хорньик, К., Варга, Н., Бургян, Дж., Кауппинен, С., Хавелда, З. (2004) Чувствительное и специфическое обнаружение микроРНК с помощью нозерн-блот-анализа с использованием LNA-модифицированных олигонуклеотидных зондов. Нук. Исследования кислот. 32: е175.
- ^ Перейти обратно: а б Гортнер, Г.; Пфеннингер, М.; Каль, Г.; Вейзинг, К. (1996). «Нозерн-блот-анализ транскрипции простых повторяющихся последовательностей у растений». Электрофорез . 17 (7): 1183–1189. дои : 10.1002/elps.1150170702 . ПМИД 8855401 . S2CID 36857667 .
- ^ Перейти обратно: а б Лян, П. Парди, AB (1995) Последние достижения в области дифференциального отображения. Текущее мнение Иммунол. 7: 274–280.
- ^ Перейти обратно: а б Энглер-Блюм, Г.; Мейер, М.; Фрэнк, Дж.; Мюллер, Джорджия (1993). «Уменьшение фоновых проблем при нерадиоактивном нозерн- и Саузерн-блот-анализе обеспечивает более высокую чувствительность, чем гибридизации на основе 32P». Анальный. Биохим . 210 (2): 235–244. дои : 10.1006/abio.1993.1189 . ПМИД 7685563 .
- ^ Перейти обратно: а б Болдуин Д., Крейн В., Райс Д. (1999) Сравнение методов гелевого, нейлонового фильтра и микрочипов для обнаружения дифференциальной экспрессии РНК в растениях. Текущее мнение по биол. растений. 2: 96–103.
- ^ Перейти обратно: а б Утанс, У.; Лян, П.; Винер, ЛР; Карновский, МЮ; Рассел, Мэн (1994). «Хроническое сердечное отторжение: идентификация пяти генов с повышенной регуляцией в трансплантированных сердцах с помощью дифференциального отображения мРНК» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 91 (14): 6463–6467. Бибкод : 1994PNAS...91.6463U . дои : 10.1073/pnas.91.14.6463 . ПМЦ 44222 . ПМИД 8022806 .
- ^ Перейти обратно: а б Танигучи, М.; Миура, К.; Ивао, Х.; Яманака, С. (2001). «Количественная оценка ДНК-микрочипов - сравнение с нозерн-блот-анализом». Геномика . 71 (1): 34–39. дои : 10.1006/geno.2000.6427 . ПМИД 11161795 .
- ^ Крефт К., Крефт С., Комель Р., Грубич З. (2000). Нерадиоактивный нозерн-блоттинг для определения мРНК ацетилхолинэстеразы. Арка Пфлюгерса – Eur J Physiol, 439:R66-R67
Внешние ссылки
[ редактировать ]
Молекулярная генетика : основные методы исследования |
|---|
