Вектор трансформации растений
Векторы трансформации растений представляют собой плазмиды , специально разработанные для облегчения создания трансгенных растений . Наиболее часто используемыми векторами трансформации растений являются бинарные векторы Т-ДНК , которые часто реплицируются как в E. coli , распространенной лабораторной бактерии , так и в Agrobacterium tumefaciens , вирулентной для растений бактерии, используемой для встраивания рекомбинантной ДНК в растения.
Векторы трансформации растений содержат три ключевых элемента:
- Отбор плазмид (создание собственной кольцевой цепи ДНК)
- Репликация плазмид (чтобы с ней можно было легко работать)
- Область переноса ДНК (Т-ДНК) (вставка ДНК в агробактерии)
Этапы трансформации растений
[ редактировать ]Пользовательскую последовательность ДНК-плазмиды можно создать и реплицировать различными способами, но, как правило, все методы используют следующие процессы:
Трансформация растений с помощью плазмид начинается с размножения бинарного вектора в E. coli. Когда бактериальная культура достигает соответствующей плотности, бинарный вектор выделяют и очищают. Затем можно ввести чужеродный ген. Сконструированный бинарный вектор, включающий чужеродный ген, повторно вводят в E. coli для амплификации.
Сконструированный бинарный фактор выделяют из E.coli и вводят в Agrobacteria, содержащую модифицированную (относительно небольшую) плазмиду Ti. Эти модифицированные агробактерии можно использовать для заражения растительных клеток. Т-ДНК, содержащая чужеродный ген, интегрируется в геном растительной клетки. В каждой инфицированной клетке Т-ДНК интегрируется в разные участки генома.
Все растение регенерирует из одной трансформированной клетки, в результате чего трансформированная ДНК интегрирована одинаково во все клетки организма.
Последствия прошивки
[ редактировать ]- Вставлена чужеродная ДНК
- Инсерционный мутагенез (но не смертелен для растительной клетки – организм диплоидный)
- Трансформационная ДНК, скармливаемая грызунам, попадает в их фагоциты и редко в другие клетки. В частности, это относится к бактериальной ДНК и ДНК М13 . (Считается, что это преимущественное накопление в фагоцитах является реальным, а не артефактом обнаружения, поскольку считается, что эти последовательности ДНК провоцируют фагоцитоз .) Однако известно, что никакая экспрессия генов не привела к этому, и это не считается возможным. [ 1 ] [ 2 ]
Выбор плазмиды
[ редактировать ]Ген-селектор можно использовать для отличения успешно генетически модифицированных клеток от немодифицированных. Ген-селектор интегрируется в плазмиду вместе с желаемым геном-мишенью, обеспечивая клеткам устойчивость к антибиотику , такому как канамицин , ампициллин , спектиномицин или тетрациклин . Желаемые клетки, а также любые другие организмы, растущие в культуре, можно обработать антибиотиком, что позволит выжить только модифицированным клеткам. Ген антибиотика обычно не переносится в растительную клетку, а остается внутри бактериальной клетки.
Репликация плазмид
[ редактировать ]Плазмиды реплицируются, образуя множество плазмидных молекул в каждой бактериальной клетке-хозяине. Количество копий каждой плазмиды в бактериальной клетке определяется местом начала репликации , которое представляет собой положение внутри молекулы плазмиды, где инициируется репликация ДНК. Большинство бинарных векторов имеют большее количество копий плазмид при репликации в E. coli ; однако число копий плазмиды обычно ниже, когда плазмида находится в составе Agrobacterium tumefaciens . Плазмиды также можно реплицировать с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Область Т-ДНК
[ редактировать ]Т-ДНК содержит два типа генов: онкогенные гены , кодирующие ферменты, участвующие в синтезе ауксинов и цитокининов и ответственные за образование опухолей , и гены, кодирующие синтез опинов . Эти соединения, образующиеся в результате конденсации аминокислот и сахаров, синтезируются и выделяются клетками корончатого галла и потребляются A. tumefaciens в качестве источников углерода и азота.
Гены, участвующие в катаболизме опина , переносе Т-ДНК из бактерии в растительную клетку и конъюгативном переносе бактериальной плазмиды, расположены вне Т-ДНК. [ 3 ] [ 4 ] Фрагмент Т-ДНК фланкирован прямыми повторами длиной 25 п.н., которые действуют как сигнал цис-элемента для аппарата переноса. Процесс переноса Т-ДНК опосредован совместным действием белков, кодируемых генами, детерминированными в области вирулентности Ti-плазмиды (гены vir) и в бактериальной хромосоме. Плазмида Ti также содержит гены катаболизма опина, продуцируемые клетками корончатого галла, и области для конъюгативного переноса, а также для ее собственной целостности и стабильности. Область вирулентности (vir) размером 30 т.п.н. представляет собой регулон, организованный в шесть оперонов, необходимых для переноса Т-ДНК (virA, virB, virD и virG) или для повышения эффективности переноса (virC и virE). [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] Несколько хромосомно-детерминированных генетических элементов показали свою функциональную роль в прикреплении A. tumefaciens к растительной клетке и бактериальной колонизации. Локусы chvA и chvB участвуют в синтезе и выделении b-1,2- глюкана . [ 6 ] chvE необходим для усиления сахаром индукции генов vir и бактериального хемотаксиса . [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ] Локус клетки отвечает за синтез фибрилл целлюлозы . [ 10 ] Локус pscA (exoC) участвует в синтезе как циклического глюкана, так и кислого сукциногликана . [ 11 ] [ 9 ] Локус att участвует в белках клеточной поверхности . [ 12 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Гольдштейн, Дэниел А.; Тинланд, Бруно; Гилбертсон, Лоуренс А.; Стауб, Дж. М.; Бэннон, Джорджия; Гудман, Р.Э.; Маккой, РЛ; Сильванович, А. (2005). «Безопасность человека и генетически модифицированные растения: обзор маркеров устойчивости к антибиотикам и будущих технологий селекции трансформации». Журнал прикладной микробиологии . 99 (1). Общество прикладной микробиологии ( Уайли ): 7–23. дои : 10.1111/j.1365-2672.2005.02595.x . ISSN 1364-5072 . ПМИД 15960661 . S2CID 40454719 .
- ^ Лемо, Пегги Г. (2008). «Генетически модифицированные растения и продукты питания: научный анализ проблем (Часть I)». Ежегодный обзор биологии растений . 59 (1). Годовые обзоры : 771–812. doi : 10.1146/annurev.arplant.58.032806.103840 . ISSN 1543-5008 . ПМИД 18284373 .
- ^ Jump up to: а б Хойкаас, Пол Джей Джей; Шильпероорт, Роб А. (1 мая 1992 г.). «Агробактерии и генная инженерия растений» . Молекулярная биология растений . 19 (1): 15–38. дои : 10.1007/BF00015604 . ISSN 1573-5028 . ПМИД 1600167 . S2CID 36172990 .
- ^ Jump up to: а б Зупан, младший; Замбриски, П. (1 апреля 1995 г.). «Перенос Т-ДНК из агробактерий в растительную клетку» . Физиология растений . 107 (4): 1041–1047. дои : 10.1104/стр.107.4.1041 . ISSN 0032-0889 . ПМЦ 157234 . ПМИД 7770515 .
- ^ Чон, Кын-А; Ым, Джин Сон; Сим, Ун Соп (1 февраля 1998 г.). «Роль последовательности инвертированных повторов (IR) экспрессии гена virE в Agrobacterium tumefaciens pTiA6» . Молекулы и клетки . 8 (1): 49–53. дои : 10.1016/S1016-8478(23)13391-7 . ISSN 1016-8478 . ПМИД 9571631 .
- ^ Кангелози, Джорджия; Мартинетти, Дж; Ли, Дж.А.; Ли, CC; Тайнес, К; Нестер, EW (март 1989 г.). «Роль [исправленного] белка ChvA Agrobacterium tumefaciens в экспорте бета-1,2-глюкана» . Журнал бактериологии . 171 (3): 1609–1615. дои : 10.1128/jb.171.3.1609-1615.1989 . ISSN 0021-9193 . ПМК 209788 . ПМИД 2921245 .
- ^ Анкенбауэр, Р.Г.; Нестер, EW (ноябрь 1990 г.). «Сахар-опосредованная индукция генов вирулентности Agrobacterium tumefaciens: структурная специфичность и активность моносахаридов» . Журнал бактериологии . 172 (11): 6442–6446. дои : 10.1128/jb.172.11.6442-6446.1990 . ISSN 0021-9193 . ПМК 526831 . ПМИД 2121715 .
- ^ Кангелози, Джорджия; Анкенбауэр, Р.Г.; Нестер, EW (сентябрь 1990 г.). «Сахар индуцирует гены вирулентности Agrobacterium через периплазматический связывающий белок и трансмембранный сигнальный белок» . Труды Национальной академии наук . 87 (17): 6708–6712. Бибкод : 1990PNAS...87.6708C . дои : 10.1073/pnas.87.17.6708 . ISSN 0027-8424 . ПМК 54606 . ПМИД 2118656 .
- ^ Jump up to: а б Кангелози, Джерард А.; Абест, Элейн; Мартинетти, Глэдис; Нестер, Юджин В. (1991), «Генетический анализ агробактерий», Бактериальные генетические системы , Методы энзимологии, том. 204, Elsevier, стр. 384–397, doi : 10.1016/0076-6879(91)04020-o , ISBN. 978-0-12-182105-0 , PMID 1658565 , получено 9 марта 2024 г.
- ^ Маттисс, AG (май 1983 г.). «Роль фибрилл бактериальной целлюлозы в инфекции Agrobacterium tumefaciens» . Журнал бактериологии . 154 (2): 906–915. дои : 10.1128/jb.154.2.906-915.1983 . ISSN 0021-9193 . ПМК 217544 . ПМИД 6302086 .
- ^ Кангелози, Джорджия; Хунг, Л; Пуванешараджа, В; Стейси, Дж; Озга, Д.А.; Ли, Дж.А.; Нестер, EW (май 1987 г.). «Общие локусы синтеза экзополисахаридов Agrobacterium tumefaciens и Rhizobium meliloti и их роль во взаимодействии растений» . Журнал бактериологии . 169 (5): 2086–2091. дои : 10.1128/jb.169.5.2086-2091.1987 . ISSN 0021-9193 . ПМК 212098 . ПМИД 3571162 .
- ^ Маттисс, Энн Г. (октябрь 1987 г.). «Влияние плазмиды pSa и ауксина на прикрепление Agrobacterium tumefaciens к клеткам моркови» . Прикладная и экологическая микробиология . 53 (10): 2574–2582. Бибкод : 1987ApEnM..53.2574M . дои : 10.1128/aem.53.10.2574-2582.1987 . ISSN 0099-2240 . ПМК 204148 . ПМИД 16347473 .
- Техническая направленность: руководство по бинарным Ti-векторам Agrobacterium. Тенденции в науке о растениях 5 (10): 446-451, 2000 г.