Число копий плазмиды

В клеточной биологии — число копий плазмиды это количество копий данной плазмиды в клетке. Чтобы обеспечить выживание и, следовательно, дальнейшее распространение плазмиды, они должны регулировать количество своих копий. Если плазмида имеет слишком большое число копий, они могут чрезмерно обременять своего хозяина, занимая слишком много клеточных механизмов и используя слишком много энергии. С другой стороны, слишком низкое число копий может привести к тому, что плазмида не будет присутствовать во всем потомстве хозяина. Плазмиды могут представлять собой плазмиды с низким, средним или высоким числом копий; механизмы регуляции между плазмидами с низким и средним числом копий различны. Низкокопийные плазмиды (5 или менее копий на хозяина) требуют либо системы разделения , либо пары токсин-антитоксин, такой как CcdA/CcdB, чтобы гарантировать получение каждой дочерней плазмиды. Например, плазмида F, которая является источником BAC ( бактериальных искусственных хромосом ), представляет собой однокопийную плазмиду с системой разделения, закодированной в опероне, расположенном рядом с источником плазмиды. Система разделения взаимодействует с септирующим аппаратом, чтобы гарантировать, что каждая дочь получит копию плазмиды. Много В биотехнологических приложениях используются мутированные плазмиды, которые реплицируются с большим количеством копий. Например, pBR322 представляет собой плазмиду со средним числом копий (~20 копий/клетку), из которой несколько векторов клонирования с высоким числом копий (>100 копий/клетку), таких как хорошо известная серия pUC. путем мутагенеза было получено ^{[ 1 ]} Это обеспечивает удобство высоких выходов плазмидной ДНК, но дополнительное бремя большого количества копий ограничивает размер плазмиды. Плазмиды большего размера с высокой копией (> 30 КБ) не пользуются популярностью, а также склонны к уменьшению размера в результате делеционного мутагенеза.

Регулирование

Плазмиды со средним числом копий, также называемые расслабленными плазмидами, требуют системы, обеспечивающей ингибирование репликации, когда количество плазмид в клетке достигает определенного порога. Релаксированные плазмиды обычно регулируются посредством одного из двух механизмов: антисмысловой РНК или групп, связывающих итероны . Плазмиды с низким числом копий, также называемые строгими плазмидами, требуют более жесткого контроля репликации.

Плазмиды, производные ColE1: антисмысловая РНК

В плазмидах, происходящих из ColE1 , репликация в первую очередь регулируется с помощью небольшой РНК, кодируемой плазмидой, называемой РНК I. Репликацию в ColE1 инициирует один промотор: промотор РНК II. РНК II Транскрипт образует стабильный гибрид РНК-ДНК с матричной цепью ДНК вблизи начала репликации, где он затем обрабатывается H РНКазой с образованием 3'-OH-праймера , который ДНК-полимераза I использует для инициации синтеза ведущей цепи ДНК . РНК I служит основным кодируемым плазмидой ингибитором этого процесса, концентрация которого пропорциональна числу копий плазмиды. РНК I точно комплементарна 5'-концу РНК II (поскольку она транскрибируется с противоположной цепи того же участка ДНК, что и РНК II). РНК I и РНК II управляли комплексом поцелуя. Комплекс поцелуя стабилизируется белком Rop (репрессором праймера), и образуется двухцепочечный дуплекс РНК-I/РНК-II. Эта измененная форма предотвращает гибридизацию РНК II с ДНК и процессинг РНКазы H с образованием праймера, необходимого для инициации репликации плазмиды. По мере увеличения концентрации плазмиды вырабатывается больше РНК I, что все больше ингибирует репликацию, что приводит к регуляции количества копий. ^{[ 2 ]}^{[ 3 ]}

Плазмиды R1 и ColIb-p9: антисмысловая РНК

Большинству плазмид требуется кодируемый плазмидой белок, обычно называемый Rep, для разделения нитей ДНК в начале репликации ( oriV ) и инициации репликации ДНК. Rep связывается со специфическими последовательностями ДНК в oriV, которые уникальны для типа плазмиды. Синтез белка Rep контролируется, чтобы ограничить репликацию плазмиды и, следовательно, регулировать количество копий. В плазмиде R1 RepA может транскрибироваться с двух разных промоторов. Он создается из первого промотора до тех пор, пока плазмида не достигнет своего числа копий, после чего белок CopB репрессирует этот первичный промотор. ^{[ 3 ]} Экспрессия RepA также регулируется посттранскрипционно со вторичного промотора с помощью антисмысловой РНК, называемой CopA . CopA взаимодействует со своей РНК-мишенью в мРНК RepA и образует поцелуйный комплекс, а затем дуплекс РНК-РНК. Полученная двухцепочечная РНК расщепляется РНКазой III , предотвращая синтез RepA. Чем выше концентрация плазмиды, тем больше РНК CopA вырабатывается и тем меньше белка RepA может быть синтезировано, что усиливает ингибирование репликации плазмиды. ^{[ 4 ]}

Col1b-P9: Антисмысловая РНК

Репликация ColIb-P9 с низким числом копий зависит от Rep, который вырабатывается путем экспрессии гена RepZ . Экспрессия RepZ требует образования псевдоузла в мРНК. RepZ репрессируется небольшой антисмысловой РНК Inc, которая связывается с мРНК RepZ , образует дуплекс Inc РНК-мРНК и предотвращает образование псевдоузла, ингибирующего трансляцию RepZ в Rep. В этом случае репликация больше не может происходить. ^{[ 5 ]}

pSC101: итеронная плазмида

Плазмиды итеронов, включая плазмиды, родственные F и RK2 , имеют области oriV , содержащие множественные (~ 3-7) повторы последовательностей итеронов длиной 17-22 п.н. ^{[ 3 ]} pSC101 представляет собой простую модель итеронной плазмиды. Плазмиды итеронов контролируют количество копий с помощью двух комбинированных методов, подходящих для плазмид с низким числом копий и строгими требованиями. Одним из методов является контроль синтеза RepA. RepA — единственный белок, кодируемый плазмидой, необходимый для репликации в pSC101. Белок RepA подавляет собственный синтез, связываясь со своей собственной промоторной областью и блокируя собственную транскрипцию ( ауторегуляция транскрипции ). Таким образом, чем больше образуется RepA, тем сильнее подавляется его синтез, что впоследствии ограничивает репликацию плазмиды. ^{[ 3 ]} Гипотеза сочетания предполагает, что второй метод - это связывание плазмид через белок Rep и последовательности итеронов. Когда концентрация плазмиды высока, плазмиды RepA, связанные с итеронами, образуют димеры между двумя плазмидами, «сковывая» их наручниками в начале репликации и ингибируя репликацию. ^{[ 6 ]}

Несовместимость

Плазмиды могут быть несовместимы, если они используют один и тот же механизм контроля репликации. В этих обстоятельствах обе плазмиды вносят вклад в общее число копий и регулируются вместе. Они не признаются как отдельные плазмиды. Таким образом, становится гораздо более вероятным, что одна из плазмид может быть скопирована другой и потеряна во время клеточного деления (клетка «излечивается» от плазмиды). ^{[ 3 ]} Это особенно вероятно для плазмид с низким числом копий. Плазмиды также могут быть несовместимы из-за общих систем разделения .

Ссылки

^ Борос, я; Посфаи, Г; Венецианец, П. (октябрь 1984 г.). «Высококопийные производные плазмидного клонирующего вектора pBR322». Джин . 30 (1–3): 257–60. дои : 10.1016/0378-1119(84)90130-6 . ПМИД 6096220 .
^ Чезарени, Г; Хельмер-Циттерих, М; Кастаньоли, Л. (1991). «Контроль репликации плазмиды ColE1 с помощью антисмысловой РНК». Тенденции в генетике . 7 (7): 230–235. дои : 10.1016/0168-9525(91)90370-6 . ПМИД 1887504 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и Снайдер, Ларри; Питерс, Джозеф Э.; Хенкин, Тина М.; Чампнесс, Венди (2013). Молекулярная генетика бактерий (4-е изд.). АСМ Пресс. ISBN 978-1555816278 .
^ Бломберг, П; Нордстрем, К; Вагнер, Э.Г. (1992). «Контроль репликации плазмиды R1: синтез RepA регулируется РНК CopA посредством ингибирования трансляции лидерного пептида» . Журнал ЭМБО . 11 (7): 2675–2683. дои : 10.1002/j.1460-2075.1992.tb05333.x . ПМЦ 556743 . ПМИД 1378398 .
^ Асано, К; Мизобути, К. (1998). «Контроль числа копий плазмиды IncIalpha ColIb-P9 путем конкуренции между образованием псевдоузла и связыванием антисмысловой РНК в определенном сайте РНК» . Журнал ЭМБО . 17 (17): 5201–5213. дои : 10.1093/emboj/17.17.5201 . ПМЦ 1170848 . ПМИД 9724656 .
^ Куннималайян, С; Инман, РБ; Раковский, SA; Филутович, М (2005). «Роль π-димеров в связывании («наручниках») γ ori итеронов плазмиды R6K» . Журнал бактериологии . Откр. 187 (11): 3779–3785. дои : 10.1128/JB.187.11.3779–3785.2005 . ПМК 1112066 . ПМИД 15901701 .

[1] Борос, я; Посфаи, Г; Венецианец, П. (октябрь 1984 г.). «Высококопийные производные плазмидного клонирующего вектора pBR322». Джин . 30 (1–3): 257–60. дои : 10.1016/0378-1119(84)90130-6 . ПМИД 6096220 .

[2] Чезарени, Г; Хельмер-Циттерих, М; Кастаньоли, Л. (1991). «Контроль репликации плазмиды ColE1 с помощью антисмысловой РНК». Тенденции в генетике . 7 (7): 230–235. дои : 10.1016/0168-9525(91)90370-6 . ПМИД 1887504 .

[snyder-3] Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и Снайдер, Ларри; Питерс, Джозеф Э.; Хенкин, Тина М.; Чампнесс, Венди (2013). Молекулярная генетика бактерий (4-е изд.). АСМ Пресс. ISBN 978-1555816278 .

[4] Бломберг, П; Нордстрем, К; Вагнер, Э.Г. (1992). «Контроль репликации плазмиды R1: синтез RepA регулируется РНК CopA посредством ингибирования трансляции лидерного пептида» . Журнал ЭМБО . 11 (7): 2675–2683. дои : 10.1002/j.1460-2075.1992.tb05333.x . ПМЦ 556743 . ПМИД 1378398 .

[5] Асано, К; Мизобути, К. (1998). «Контроль числа копий плазмиды IncIalpha ColIb-P9 путем конкуренции между образованием псевдоузла и связыванием антисмысловой РНК в определенном сайте РНК» . Журнал ЭМБО . 17 (17): 5201–5213. дои : 10.1093/emboj/17.17.5201 . ПМЦ 1170848 . ПМИД 9724656 .

[6] Куннималайян, С; Инман, РБ; Раковский, SA; Филутович, М (2005). «Роль π-димеров в связывании («наручниках») γ ori итеронов плазмиды R6K» . Журнал бактериологии . Откр. 187 (11): 3779–3785. дои : 10.1128/JB.187.11.3779–3785.2005 . ПМК 1112066 . ПМИД 15901701 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]