Инсерционный мутагенез

В молекулярной биологии инсерционный мутагенез – это создание мутаций в ДНК путем добавления одной или нескольких пар оснований . Такие инсерционные мутации могут возникать естественным путем, опосредованно вирусами или транспозонами , или могут быть искусственно созданы для исследовательских целей в лаборатории.

Сигнатурный мутагенез

Это метод, используемый для изучения функции генов . Транспозону , такому как элемент P Drosophila melanogaster, разрешено интегрироваться в случайные места генома изучаемого организма. Мутанты, полученные этим методом, затем проверяются на наличие необычных фенотипов . Если такой фенотип обнаружен, то можно предположить, что инсерция привела к инактивации гена, относящегося к обычному фенотипу. Поскольку последовательность транспозона известна, ген можно идентифицировать либо путем секвенирования всего генома и поиска последовательности, либо с помощью полимеразной цепной реакции для специфичной амплификации этого гена.

Вирусный инсерционный мутагенез

Поскольку многие вирусы интегрируют свои собственные геномы в геномы клеток-хозяев для репликации, мутагенез, вызванный вирусными инфекциями, является довольно распространенным явлением. Однако не все интегрирующиеся вирусы вызывают инсерционный мутагенез.

Некоторые вставки ДНК не приводят к заметным мутациям. Исторически сложилось так, что лентивирусные векторы включали сильные вирусные промоторы, которые имели побочный эффект инсерционного мутагенеза , мутаций ядерной ДНК, влияющих на функцию гена. ^[1] Было показано, что эти сильные вирусные промоторы являются основной причиной образования рака . ^[1] В результате вирусные промоторы были заменены клеточными промоторами и регуляторными последовательностями. ^[1] Для таких вирусов, как гаммаретровирусы , которые имеют тенденцию интегрировать свою ДНК в генетически неблагоприятные места, тяжесть любой последующей мутации полностью зависит от места в геноме хозяина, в котором вставлена вирусная ДНК. Если ДНК вставить в середину важного гена, последствия для клетки будут радикальными. гена Кроме того, вставка в промоторную область может иметь столь же радикальные последствия. Аналогичным образом, если вирусная ДНК вставлена в репрессор , соответствующий ген промотора может сверхэкспрессироваться, что приводит к избытку его продукта и изменению клеточной активности. гена Если ДНК вставлена в энхансерную область , экспрессия гена может быть недостаточной, что приводит к относительному отсутствию его продукта, что может существенно нарушить активность клетки.

Изменение различных генов будет иметь различное воздействие на клетку. Не все мутации существенно влияют на пролиферацию клетки. Однако, если вставка происходит в важный ген или ген, который участвует в клеточной репликации или запрограммированной гибели клеток , вставка может поставить под угрозу жизнеспособность клетки или даже вызвать бесконечную репликацию клетки, что приводит к образованию опухоли. который может стать раковым.

Инсерционный мутагенез возможен независимо от того, относится ли вирус к самоинактивирующемуся типу, обычно используемому в генной терапии, или к способному к репликации. Вирус встраивает ген (известный как вирусный онкоген), обычно рядом с клеточным геном myc (c-myc). Ген c-myc обычно выключен в клетке; однако, когда он включен, он способен подтолкнуть клетку к фазе G1 клеточного цикла и заставить клетку начать репликацию, вызывая неконтролируемую пролиферацию клеток, одновременно позволяя реплицироваться вирусному гену. После многих репликаций, когда вирусный ген остается в скрытом состоянии, опухоли начинают расти. Эти опухоли обычно происходят из одной мутировавшей/ трансформированной клетки (клональной по происхождению). Вирус птичьего лейкоза является примером вируса, вызывающего заболевание путем инсерционного мутагенеза. У только что вылупившихся цыплят, инфицированных вирусом птичьего лейкоза, начнут образовываться опухоли, которые начнут появляться в их фабрициевой сумке (как и в тимусе человека). Эта вставка вирусного гена также известна как вставка промотора, поскольку она управляет экспрессией гена c-myc. Существует пример события инсерционного мутагенеза, вызванного ретротранспозон в геноме человека, где он вызывает мышечную дистрофию типа Фукуямы. ^[2]

Инсерционная инактивация

Инсерционная инактивация — это метод, используемый в инженерии рекомбинантной ДНК , при котором плазмида (например, pBR322 ) ^[3] используется для отключения экспрессии гена. ^[4]

Инактивация гена путем вставки фрагмента ДНК в середину его кодирующей последовательности. Любые будущие продукты из инактивированного гена не будут работать из-за добавленных к нему дополнительных кодов. Примером может служить использование pBR322, гены которого кодируют соответственно полипептиды, придающие устойчивость к антибиотикам ампициллина и тетрациклина. Следовательно, когда генетическая область прерывается интеграцией pBR322, функция гена теряется, но приобретается новая функция гена (устойчивость к специфическим антибиотикам).

Альтернативная стратегия инсерционного мутагенеза использовалась у позвоночных животных для поиска генов, вызывающих рак. В этом случае транспозон, например « Спящая красавица» , предназначен для прерывания работы гена таким образом, чтобы вызвать максимальный генетический хаос. В частности, транспозон содержит сигналы об усечении экспрессии прерванного гена в месте вставки и последующем возобновлении экспрессии второго усеченного гена. Этот метод использовался для идентификации онкогенов . ^[5]^[6]

См. также

Ссылки

^ Jump up to: ^а ^б ^с Полетти, Валентина; Мавилио, Фульвио (2021). «Разработка лентивирусных векторов для генной терапии генетических заболеваний» . Вирусы . 13 (8): 5. дои : 10.3390/v13081526 . ISSN 1999-4915 . ПМЦ 8402868 . ПМИД 34452394 . {{cite journal}}: CS1 maint: дата и год ( ссылка )
^ «Ретровирусы» . Архивировано из оригинала 4 мая 2015 года.
^ «Рекомбинантная ДНК» . Архивировано из оригинала 5 августа 2012 г. Проверено 11 апреля 2010 г.
^ «Инсерционная инактивация» . Архивировано из оригинала 18 февраля 2009 г. Проверено 11 апреля 2010 г.
^ Карлсон CM, Ларгаэспада DA (июль 2005 г.). «Инсерционный мутагенез у мышей: новые перспективы и инструменты». Нат. Преподобный Жене . 6 (7): 568–80. дои : 10.1038/nrg1638 . ПМИД 15995698 . S2CID 3194633 .
^ Ивикс З., Изсвак З. (2004). «Мобильные элементы для трансгенеза и инсерционного мутагенеза у позвоночных: современный обзор экспериментальных стратегий». Мобильные генетические элементы . Методы Мол. Биол. Том. 260. стр. 255–76. дои : 10.1385/1-59259-755-6:255 . ISBN 1-59259-755-6 . ПМИД 15020812 .

Внешние ссылки

Инсерционный+мутагенез в Национальной медицинской библиотеке США по медицинским предметным рубрикам (MeSH)
Схема на сайте Gene-Technology-online.com.

[:1-1] Jump up to: ^а ^б ^с Полетти, Валентина; Мавилио, Фульвио (2021). «Разработка лентивирусных векторов для генной терапии генетических заболеваний» . Вирусы . 13 (8): 5. дои : 10.3390/v13081526 . ISSN 1999-4915 . ПМЦ 8402868 . ПМИД 34452394 . {{cite journal}}: CS1 maint: дата и год ( ссылка )

[2] «Ретровирусы» . Архивировано из оригинала 4 мая 2015 года.

[3] «Рекомбинантная ДНК» . Архивировано из оригинала 5 августа 2012 г. Проверено 11 апреля 2010 г.

[4] «Инсерционная инактивация» . Архивировано из оригинала 18 февраля 2009 г. Проверено 11 апреля 2010 г.

[5] Карлсон CM, Ларгаэспада DA (июль 2005 г.). «Инсерционный мутагенез у мышей: новые перспективы и инструменты». Нат. Преподобный Жене . 6 (7): 568–80. дои : 10.1038/nrg1638 . ПМИД 15995698 . S2CID 3194633 .

[6] Ивикс З., Изсвак З. (2004). «Мобильные элементы для трансгенеза и инсерционного мутагенеза у позвоночных: современный обзор экспериментальных стратегий». Мобильные генетические элементы . Методы Мол. Биол. Том. 260. стр. 255–76. дои : 10.1385/1-59259-755-6:255 . ISBN 1-59259-755-6 . ПМИД 15020812 .

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]