Транспозонный мутагенез

Транспозонный мутагенез , или транспозиционный мутагенез , представляет собой биологический процесс, который позволяет переносить гены в хромосому организма-хозяина , прерывая или изменяя функцию существующего гена на хромосоме и вызывая мутацию . ^[1] Транспозонный мутагенез гораздо более эффективен, чем химический мутагенез , поскольку имеет более высокую частоту мутаций и меньшую вероятность гибели организма. Другие преимущества включают возможность вызывать однократные мутации, возможность включать селектируемые маркеры в конструирование штамма и возможность восстанавливать гены после мутагенеза. ^[2] К недостаткам относятся низкая частота транспозиции в живых системах и неточность большинства систем транспозиции.

История

Мутагенез транспозонов был впервые изучен Барбарой МакКлинток в середине 20 века во время ее работы с кукурузой, получившей Нобелевскую премию. МакКлинток получила степень бакалавра наук в 1923 году в Сельскохозяйственном колледже Корнелла. К 1927 году она получила докторскую степень по ботанике и сразу же начала работать над темой хромосом кукурузы . ^[3] В начале 1940-х годов МакКлинток изучал потомство самоопыляемых растений кукурузы, полученное в результате скрещивания с сломанной хромосомой 9. У этих растений отсутствовали теломеры . Это исследование привело к первому открытию мобильного элемента . ^[4] и с тех пор мутагенез транспозонов стал использоваться как биологический инструмент.

Динамика

В случае бактерий транспозиционный мутагенез обычно осуществляется с помощью плазмиды, из которой транспозон извлекается и вставляется в хромосому хозяина. набора ферментов включая транспозазу Обычно для этого требуется трансляция , . Транспозаза может экспрессироваться либо на отдельной плазмиде, либо на плазмиде, содержащей ген, подлежащий интеграции. Альтернативно, инъекция мРНК транспозазы в клетку-хозяина может индуцировать трансляцию и экспрессию . ^[5] Ранние эксперименты по мутагенезу транспозонов основывались на бактериофагах и конъюгативных бактериальных плазмидах для встраивания последовательностей. Они были очень неспецифичными и затрудняли включение определенных генов. Новый метод, называемый челночным мутагенезом, использует определенные клонированные гены вида-хозяина для включения генетических элементов. ^[2] Другой эффективный подход — доставка транспозонов через вирусные капсиды . Это облегчает интеграцию в хромосому и долговременную экспрессию трансгена . ^[5]

Транспозонная система Tn5

Транспозонная система Tn5 является модельной системой для изучения транспозиции и применения мутагенеза транспозонов. Tn5 представляет собой бактериальный составной транспозон, в котором гены (исходная система, содержащая гены устойчивости к антибиотикам ) фланкированы двумя почти идентичными инсерционными последовательностями , названными IS50R и IS50L, соответствующими правой и левой сторонам транспозона соответственно. ^[6] Последовательность IS50R кодирует два белка: Tnp и Inh. Эти два белка идентичны по последовательности, за исключением того факта, что в Inh отсутствуют 55 N-концевых аминокислот . Tnp кодирует транспозазу для всей системы, а Inh кодирует ингибитор транспозазы. ДНК-связывающий домен Tnp находится в 55 N-концевых аминокислотах, поэтому эти остатки необходимы для функционирования. ^[6] Последовательности IS50R и IS50L фланкированы элементами из 19 пар оснований на внутреннем и внешнем концах транспозона, обозначенных IE и OE соответственно. Мутация этих областей приводит к неспособности генов транспозазы связываться с последовательностями. Взаимодействия связывания между транспозазой и этими последовательностями очень сложны и зависят от метилирования ДНК и других эпигенетических меток. ^[6] Кроме того, другие белки, по-видимому, способны связываться с элементами IS50 и влиять на их транспозицию, например DnaA.

Наиболее вероятный путь транспозиции Tn 5 является общим для всех транспозонных систем. Он начинается с связывания Tnp с последовательностями OE и IE каждой последовательности IS50. Два конца соединяются, и в результате олигомеризации ДНК последовательность вырезается из хромосомы. После введения 5'- концов пары 9 оснований в целевую ДНК транспозон и включенные в него гены встраиваются в целевую ДНК, дублируя области на обоих концах транспозона. ^[6] Гены, представляющие интерес, могут быть генетически встроены в систему транспозонов между последовательностями IS50. Поместив транспозон под контроль промотора- хозяина , гены будут экспрессироваться. Встроенные гены обычно включают в себя, помимо интересующего гена, селектируемый маркер для идентификации трансформантов, эукариотический промотор/ терминатор (если экспрессируется в эукариоте) и последовательности 3'- UTR для разделения генов в полицистронном участке последовательности.

Транспозонная система «Спящая красавица»

Транспозонная система «Спящая красавица» (SBTS) — первый успешный невирусный вектор для включения генной кассеты в геном позвоночных . Вплоть до разработки этой системы основными проблемами невирусной генной терапии были внутриклеточный распад трансгена из-за его признания прокариотами и неэффективная доставка трансгена в системы органов. SBTS совершил революцию в этих вопросах, объединив преимущества вирусов и обнаженной ДНК. Он состоит из транспозона, содержащего кассету экспрессируемых генов, а также собственного фермента транспозазы. Путем переноса кассеты непосредственно в геном организма из плазмиды можно добиться устойчивой экспрессии трансгена. ^[2] Это можно дополнительно уточнить путем улучшения последовательностей транспозонов и используемых ферментов транспозаз. SB100X — это гиперактивная транспозаза млекопитающих, которая примерно в 100 раз более эффективна, чем типичная транспозаза первого поколения. Включение этого фермента в кассету приводит к еще более продолжительной экспрессии трансгена (более одного года). Кроме того, частота трансгенеза может достигать 45% при использовании пронуклеарной инъекции в зиготы мыши . ^[7]

Механизм SBTS аналогичен системе транспозонов Tn5, однако последовательности ферментов и генов имеют эукариотическую природу, а не прокариотическую. Транпозаза системы может действовать как в транс, так и в цис , позволяя создавать разнообразную коллекцию транспозонных структур. Сам транспозон фланкирован инвертированными повторяющимися последовательностями , каждая из которых повторяется дважды в прямом порядке, называемыми последовательностями IR/DR. Внутренняя область состоит из транспонируемого гена или последовательности и может также содержать ген транспозазы. Альтернативно, транспозаза может быть закодирована на отдельной плазмиде или введена в виде белка. Еще один подход заключается во включении генов транспозона и транспозазы в вирусный вектор, который может быть нацелен на выбранную клетку или ткань. Белок транспозаза чрезвычайно специфичен в отношении последовательностей, с которыми он связывается, и способен отличать свои последовательности IR/DR от аналогичной последовательности по трем парам оснований. Как только фермент связывается с обоими концами транспозона, последовательности IR/DR объединяются и удерживаются транспозазой в образовании синаптического комплекса (SCF). Формирование SCF является контрольной точкой, обеспечивающей правильное расщепление. HMGB1 представляет собой негистоновый . белок хозяина, который связан с хроматином эукариот Он усиливает предпочтительное связывание транспозазы с последовательностями IR/DR и, вероятно, имеет важное значение для образования/стабильности комплекса SCF. Транспозаза расщепляет ДНК в целевых участках, образуя 3'-выступы . Затем фермент нацеливается на динуклеотиды ТА в геноме хозяина как на целевые сайты для интеграции. Тот же ферментативный каталитический сайт, который расщепляет ДНК, отвечает за интеграцию ДНК в геном, дублируя при этом область генома. Хотя транспозаза специфична для динуклеотидов ТА, высокая частота этих пар в геноме указывает на то, что транспозон подвергается довольно случайной интеграции. ^[8]

Практическое применение

В результате способности мутагенеза транспозонов включать гены в большинство областей хромосом-мишеней, с этим процессом связан ряд функций.

Гены вирулентности в вирусах и бактериях можно обнаружить, разрушая гены и наблюдая за изменением фенотипа . Это имеет важное значение для производства антибиотиков и борьбы с болезнями. ^[4]
Несущественные гены можно обнаружить, индуцируя мутагенез транспозонов в организме. Трансформированные гены затем можно идентифицировать путем проведения ПЦР организма на восстановленном геноме с использованием ORF -специфического праймера и специфичного для транспозона праймера. ^[4] Поскольку транспозоны могут включаться в некодирующие области ДНК, ORF-специфичный праймер гарантирует, что транспозон прервал работу гена. Поскольку организм выжил после гомологичной интеграции , прерванный ген явно не имел существенного значения.
Гены, вызывающие рак, можно идентифицировать с помощью полногеномного мутагенеза и скрининга мутантов, содержащих опухоли. На основании механизма и результатов мутации гены, вызывающие рак, могут быть идентифицированы как онкогены или гены-супрессоры опухолей . ^[9]

Конкретные примеры

микобактерий туберкулеза Идентификация кластера генов вирулентности

В 1999 году гены вирулентности, связанные с микобактерией туберкулеза, , опосредованного мутагенезом транспозонов были идентифицированы посредством нокаута генов . Плазмида под названием pCG113, содержащая гены устойчивости к канамицину и инсерционную последовательность IS 1096, была сконструирована так, чтобы содержать вариабельные метки из 80 пар оснований. Плазмиды затем трансформировали в M.tuberculosis клетки посредством электропорации . Колонии высевали на канамицин для отбора устойчивых клеток. Колонии, подвергшиеся случайной транспозиции, идентифицировали Bam HI расщеплением по и Саузерн-блоттингом с использованием внутреннего ДНК-зонда IS 1096 . Колонии проверяли на ослабленное размножение для выявления колоний с мутациями в генах-кандидатах вирулентности. Мутации, приводящие к ослабленному фенотипу, были картированы путем амплификации областей, прилегающих к последовательностям IS 1096 , и сравнены с опубликованным геномом M.tuberculosis . В данном случае мутагенез транспозонов выявил 13 патогенных локусов в геноме M.tuberculosis , ранее не ассоциированных с заболеванием. ^[10] Это важная информация для понимания инфекционного цикла бактерии.

Мутагенез транспозонов PiggyBac (PB) для открытия генов рака

Транспозон PiggyBac был разработан так (PB) капустной плодожорки Trichoplusia ni , чтобы быть высокоактивным в клетках млекопитающих и способен к полногеномному мутагенезу. Транспозоны содержали инвертированные повторы как PB , так и «Спящей красавицы» , чтобы распознаваться обеими транспозазами и увеличивать частоту транспозиций. Кроме того, транспозон содержал элементы промотора и энхансера , донора и акцептора сплайсинга , позволяющие осуществлять мутации с усилением или потерей функции в зависимости от ориентации транспозона, а также двунаправленного полиаденилирования сигналы . Транспозоны трансформировали в мышиные клетки in vitro и анализировали мутанты, содержащие опухоли. Механизм мутации, приводящей к образованию опухоли, определил, был ли ген классифицирован как онкоген или ген опухолесупрессора. Онкогены, как правило, характеризовались вставками в области, приводящие к сверхэкспрессии гена, тогда как гены-супрессоры опухолей классифицировались как таковые на основании мутаций, приводящих к потере функции. Поскольку мышь является модельным организмом для изучения физиологии человека и болезней, это исследование поможет лучше понять гены, вызывающие рак, и потенциальные терапевтические цели. ^[9]

См. также

Ссылки

^ «Накормим голодные рты» . Программа биотехнологии: Отчеты о проектах: Анализ генома . Европейская комиссия. 2001. 2-2.
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с Зейферт, HS; Чен, EY; Итак, М; Хеффрон, Ф (1 февраля 1986 г.). «Челночный мутагенез: метод транспозонного мутагенеза Saccharomyces cerevisiae» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 83 (3): 735–739. Бибкод : 1986PNAS...83..735S . дои : 10.1073/pnas.83.3.735 . ISSN 0027-8424 . ПМЦ 322939 . ПМИД 3003748 .
^ Равиндран, Сандип (11 декабря 2012 г.). «Барбара МакКлинток и открытие прыгающих генов» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 109 (50): 20198–20199. дои : 10.1073/pnas.1219372109 . ISSN 1091-6490 . ПМЦ 3528533 . ПМИД 23236127 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с Хамер, Лисбет; ДеЗваан, Тодд М; Черногория-Чаморро, Мария Виктория; Фрэнк, Шерил А; Хамер, Джон Э (1 февраля 2001 г.). «Последние достижения в области крупномасштабного мутагенеза транспозонов». Современное мнение в области химической биологии . 5 (1): 67–73. дои : 10.1016/S1367-5931(00)00162-9 . ПМИД 11166651 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Шкипер, Кристиан А.; Андерсен, Питер Р.; Шарма, Найнн; Миккельсен, Джейкоб Г. (9 декабря 2013 г.). «Генные носители на основе ДНК-транспозонов - сцены эволюционного движения» . Журнал биомедицинской науки . 20 (1): 92. дои : 10.1186/1423-0127-20-92 . ISSN 1423-0127 . ПМЦ 3878927 . ПМИД 24320156 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д Резников, WS (1 января 1993 г.). «Транспозон Tn5». Ежегодный обзор микробиологии . 47 : 945–963. дои : 10.1146/annurev.mi.47.100193.004501 . ISSN 0066-4227 . ПМИД 7504907 .
^ Маттес, Лайош; Чуа, Марини КЛ; Страховка, Эяю; Джерхов, Борис; Манодж, Намита; Акоста-Санчес, Абель; Гржела, Дэвид П; Шмитт, Андреа; Беккер, Кэт (июнь 2009 г.). «Молекулярная эволюция новой гиперактивной транспозазы «Спящей красавицы» обеспечивает надежный стабильный перенос генов у позвоночных». Природная генетика . 41 (6): 753–761. дои : 10.1038/ng.343 . ПМИД 19412179 . S2CID 27373372 .
^ Изсвак, Жужанна; Ивикс, Золтан (01 февраля 2004 г.). «Транспозиция Спящей красавицы: биология и применение» . Молекулярная терапия . 9 (2): 147–156. дои : 10.1016/j.ymthe.2003.11.009 . ISSN 1525-0016 . ПМИД 14759798 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Рад, Роланд; Рад, Лена; Ван, Вэй; Кадинанос, Хуан; Василиу, Джордж; Райс, Стивен; Кампос, Лия С.; Юса, Косуке; Банерджи, Руби (19 ноября 2010 г.). «Мутагенез транспозонов PiggyBac: инструмент для открытия генов рака у мышей» . Наука . 330 (6007): 1104–1107. Бибкод : 2010Sci...330.1104R . дои : 10.1126/science.1193004 . ISSN 0036-8075 . ПМК 3719098 . ПМИД 20947725 .
^ Камачо, Луис Рейнальдо; Энсерге, Даниэль; Перес, Эстер; Жикель, Бриджит; Гийо, Кристоф (1 октября 1999 г.). «Идентификация кластера генов вирулентности микобактерии туберкулеза путем мутагенеза транспозонов с сигнатурными метками» . Молекулярная микробиология . 34 (2): 257–267. дои : 10.1046/j.1365-2958.1999.01593.x . ISSN 1365-2958 . ПМИД 10564470 . S2CID 21119819 .

Внешние ссылки

«Прыгающие гены: от явления к инструменту» . Генная инженерия: Растения: Окружающая среда . GMO-Safety.eu. 21 апреля 2006 г.
«Транспозонный мутагенез» - Новости пищевых ингредиентов
Эллер Джей Джей (1989). «Патогенез и иммунитет при коклюше». ДЖАМА . 261 (13): 1981–2. дои : 10.1001/jama.1989.03420130151042 .
Кук В.Б., Майлз Д. (октябрь 1988 г.). «Транспозонный мутагенез ядерных фотосинтетических генов Zea mays ». Фотосинт. Рез . 18 (1–2): 33–59. Бибкод : 1988PhoRe..18...33C . дои : 10.1007/BF00042979 . ПМИД 24425160 . S2CID 7654879 .

[1] «Накормим голодные рты» . Программа биотехнологии: Отчеты о проектах: Анализ генома . Европейская комиссия. 2001. 2-2.

[:2-2] Перейти обратно: ^а ^б ^с Зейферт, HS; Чен, EY; Итак, М; Хеффрон, Ф (1 февраля 1986 г.). «Челночный мутагенез: метод транспозонного мутагенеза Saccharomyces cerevisiae» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 83 (3): 735–739. Бибкод : 1986PNAS...83..735S . дои : 10.1073/pnas.83.3.735 . ISSN 0027-8424 . ПМЦ 322939 . ПМИД 3003748 .

[:0-3] Равиндран, Сандип (11 декабря 2012 г.). «Барбара МакКлинток и открытие прыгающих генов» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 109 (50): 20198–20199. дои : 10.1073/pnas.1219372109 . ISSN 1091-6490 . ПМЦ 3528533 . ПМИД 23236127 .

[:1-4] Перейти обратно: ^а ^б ^с Хамер, Лисбет; ДеЗваан, Тодд М; Черногория-Чаморро, Мария Виктория; Фрэнк, Шерил А; Хамер, Джон Э (1 февраля 2001 г.). «Последние достижения в области крупномасштабного мутагенеза транспозонов». Современное мнение в области химической биологии . 5 (1): 67–73. дои : 10.1016/S1367-5931(00)00162-9 . ПМИД 11166651 .

[:6-5] Перейти обратно: ^а ^б Шкипер, Кристиан А.; Андерсен, Питер Р.; Шарма, Найнн; Миккельсен, Джейкоб Г. (9 декабря 2013 г.). «Генные носители на основе ДНК-транспозонов - сцены эволюционного движения» . Журнал биомедицинской науки . 20 (1): 92. дои : 10.1186/1423-0127-20-92 . ISSN 1423-0127 . ПМЦ 3878927 . ПМИД 24320156 .

[:3-6] Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д Резников, WS (1 января 1993 г.). «Транспозон Tn5». Ежегодный обзор микробиологии . 47 : 945–963. дои : 10.1146/annurev.mi.47.100193.004501 . ISSN 0066-4227 . ПМИД 7504907 .

[:4-7] Маттес, Лайош; Чуа, Марини КЛ; Страховка, Эяю; Джерхов, Борис; Манодж, Намита; Акоста-Санчес, Абель; Гржела, Дэвид П; Шмитт, Андреа; Беккер, Кэт (июнь 2009 г.). «Молекулярная эволюция новой гиперактивной транспозазы «Спящей красавицы» обеспечивает надежный стабильный перенос генов у позвоночных». Природная генетика . 41 (6): 753–761. дои : 10.1038/ng.343 . ПМИД 19412179 . S2CID 27373372 .

[8] Изсвак, Жужанна; Ивикс, Золтан (01 февраля 2004 г.). «Транспозиция Спящей красавицы: биология и применение» . Молекулярная терапия . 9 (2): 147–156. дои : 10.1016/j.ymthe.2003.11.009 . ISSN 1525-0016 . ПМИД 14759798 .

[:5-9] Перейти обратно: ^а ^б Рад, Роланд; Рад, Лена; Ван, Вэй; Кадинанос, Хуан; Василиу, Джордж; Райс, Стивен; Кампос, Лия С.; Юса, Косуке; Банерджи, Руби (19 ноября 2010 г.). «Мутагенез транспозонов PiggyBac: инструмент для открытия генов рака у мышей» . Наука . 330 (6007): 1104–1107. Бибкод : 2010Sci...330.1104R . дои : 10.1126/science.1193004 . ISSN 0036-8075 . ПМК 3719098 . ПМИД 20947725 .

[10] Камачо, Луис Рейнальдо; Энсерге, Даниэль; Перес, Эстер; Жикель, Бриджит; Гийо, Кристоф (1 октября 1999 г.). «Идентификация кластера генов вирулентности микобактерии туберкулеза путем мутагенеза транспозонов с сигнатурными метками» . Молекулярная микробиология . 34 (2): 257–267. дои : 10.1046/j.1365-2958.1999.01593.x . ISSN 1365-2958 . ПМИД 10564470 . S2CID 21119819 .

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]