Транспозаза
Транспозаза — из класса, это любой фермент способный связываться с концом транспозона и катализировать его перемещение в другую часть генома , обычно с помощью механизма «вырезать и вставить» или механизма репликации, в процессе, известном как транспозиция. Слово «транспозаза» впервые было придумано людьми, которые клонировали фермент, необходимый для транспозиции транспозона Tn3 . [1] Существование транспозонов было постулировано в конце 1940-х годов Барбарой МакКлинток , изучавшей наследование кукурузы , но реальная молекулярная основа транспозиции была описана более поздними группами. МакКлинток обнаружил, что некоторые сегменты хромосом меняют свое положение, перепрыгивая между разными локусами или с одной хромосомы на другую. Изменение положения этих транспозонов (кодирующих цвет) позволило экспрессировать другие гены пигмента. [2] Транспозиция кукурузы вызывает изменения цвета; однако у других организмов, таких как бактерии, он может вызывать устойчивость к антибиотикам . [2] Транспозиция также важна для создания генетического разнообразия внутри видов и обеспечения адаптивности к изменяющимся условиям жизни. [3]
Транспозазы классифицируются под номером ЕС EC 2.7.7. Гены, кодирующие транспозазы, широко распространены в геномах большинства организмов и являются наиболее распространенными из известных генов. [4] В ходе эволюции человека около 40% человеческого генома изменилось с помощью таких методов, как транспозиция транспозонов. [2]
Транспозаза Tn5 [ править ]
| Домен димеризации транспозазы Tn5 | |||
|---|---|---|---|
 Транспозаза tn5: 20-мерный внешний конец 2-минутного комплекса | |||
| Идентификаторы | |||
| Символ | Dimer_Tnp_Tn5 | ||
| Пфам | PF02281 | ||
| ИнтерПро | ИПР003201 | ||
| СКОП2 | 1b7e / SCOPe / СУПФАМ | ||
| |||
Транспозаза (Tnp) Tn5 является членом суперсемейства РНКаз белков , которое включает ретровирусные интегразы . Tn5 можно найти у Shewanella и Escherichia . бактерий [5] Транспозон кодирует устойчивость к антибиотикам к канамицину и другим аминогликозидным антибиотикам. [3] [6]
Tn5 и другие транспозазы особенно неактивны. Поскольку события транспозиции ДНК по своей сути являются мутагенными, низкая активность транспозаз необходима для снижения риска возникновения фатальной мутации у хозяина и, таким образом, устранения мобильного элемента . Одна из причин, по которой Tn5 настолько нереактивен, заключается в том, что N- и C-концы расположены относительно близко друг к другу и имеют тенденцию ингибировать друг друга. Это было выяснено путем характеристики нескольких мутаций, которые привели к гиперактивным формам транспозаз. Одна из таких мутаций, L372P, представляет собой мутацию аминокислоты 372 в транспозазе Tn5. Эта аминокислота обычно представляет собой остаток лейцина в середине альфа-спирали. Когда этот лейцин заменяется остатком пролина, альфа-спираль разрывается, внося конформационные изменения в С-концевой домен, отделяя его от N-концевого домена настолько, чтобы способствовать более высокой активности белка. [3] Для транспозиции транспозона часто требуется только три части: транспозон, фермент транспозаза и ДНК-мишень для вставки транспозона. [3] Так обстоит дело с Tn5, который использует механизм вырезания и вставки для перемещения транспозонов. [3]
Tn5 и большинство других транспозаз содержат мотив DDE, который является активным сайтом, катализирующим движение транспозона. Аспартат-97, аспартат-188 и глутамат-326 составляют активный центр, который представляет собой триаду кислотных остатков. [7] Считается, что мотив DDE координирует ионы двухвалентных металлов, чаще всего магния и марганца, которые играют важную роль в каталитической реакции. [7] Поскольку транспозаза невероятно неактивна, область DDE мутирует, так что транспозаза становится гиперактивной и катализирует движение транспозона. [7] Глутамат превращается в аспартат, а два аспартата — в глутаматы. [7] Благодаря этой мутации становится возможным изучение Tn5, но в результате теряются некоторые этапы каталитического процесса. [3]
Существует несколько этапов, которые катализируют движение транспозона, включая связывание Tnp, синапсис (создание синаптического комплекса), расщепление, захват цели и перенос цепи. Затем транспозаза связывается с цепью ДНК, создает зажим на транспозонном конце ДНК и вставляется в активный сайт. Как только транспозаза связывается с транспозоном, она образует синаптический комплекс, в котором две транспозазы связаны с транспозоном в цис/транс отношениях. [3]
При расщеплении ионы магния активируют кислород из молекул воды и подвергают их нуклеофильной атаке. [6] Это позволяет молекулам воды разрывать 3'-цепи на обоих концах и создавать шпильку, которая отделяет транспозон от донорской ДНК. [3] Затем транспозаза перемещает транспозон в подходящее место. О захвате цели известно немного, хотя существует систематическая ошибка последовательности, которая еще не определена. [3] После захвата цели транспозаза атакует целевую ДНК на расстоянии девяти пар оснований, что приводит к интеграции транспозона в целевую ДНК. [3]
Как упоминалось ранее, из-за мутаций DDE некоторые этапы процесса теряются — например, когда этот эксперимент проводится in vitro , и термическая обработка SDS денатурирует транспозазу. Однако до сих пор неясно, что происходит с транспозазой in vivo . [3]
Изучение транспозазы Tn5 имеет общее значение из-за ее сходства с ВИЧ -1 и другими ретровирусными заболеваниями. Изучая Tn5, можно также многое узнать о других транспозазах и их активности. [3]
Tn5 используется при секвенировании генома путем использования Tn5 для добавления адаптеров секвенирования и фрагментации ДНК в одной ферментативной реакции в 2010 году. [8] сокращение времени и требований к вводу данных по сравнению с традиционной подготовкой библиотеки секвенирования нового поколения . Стратегия на основе Tn5 может значительно упростить протокол подготовки библиотеки и даже может быть включена в прямую ПЦР колоний для большого количества бактериальных изолятов без очевидной систематической ошибки охвата. [8] Основными недостатками являются меньший контроль размера фрагментации по сравнению с ферментативной фрагментацией и механической фрагментацией, а также склонность к высокому содержанию GC. [8] Этот способ подготовки библиотеки также используется в методике ATAC-seq .
Спящей Транспозаза красавицы
Транспозаза «Спящая красавица» (SB) — это рекомбиназа, которая управляет транспозонной системой «Спящей красавицы» . [9] Транспозаза SB принадлежит к семейству транспозаз DD[E/D], которые, в свою очередь, принадлежат к большому суперсемейству полинуклеотидилтрансфераз, включающему РНКазу H, резольвазу RuvC Холлидея, белки RAG и ретровирусные интегразы. [10] [11] Система SB используется преимущественно у позвоночных животных для переноса генов. [12] включая генную терапию, [13] [14] и открытие генов. [15] [16] Разработанный SB100X представляет собой фермент, который управляет высокими уровнями интеграции транспозонов. [17] [18]
Транспозон Tn7 [ править ]
Транспозон Tn7 представляет собой мобильный генетический элемент , обнаруженный у многих прокариот, таких как Escherichia coli ( E. coli ), и впервые был обнаружен как последовательность ДНК в бактериальных хромосомах и встречающихся в природе плазмидах , которые кодируют устойчивость к антибиотикам триметоприму и стрептомицину . [19] [20] Последовательность, специально классифицированная как мобильный элемент (транспозон), может дублировать и перемещаться внутри генома за счет использования самокодируемого фермента рекомбиназы, называемого транспозазой, что приводит к таким эффектам, как создание или обращение мутаций и изменение размера генома. Транспозон Tn7 разработал два механизма, способствующих его распространению среди прокариот. [21] Как и многие другие бактериальные транспозоны, Tn7 транспонируется с низкой частотой и встраивается во множество различных сайтов практически без сайт-селективности. По этому первому пути Tn7 преимущественно направляется в конъюгируемые плазмиды , которые могут реплицироваться и распределяться между бактериями. Однако Tn7 уникален тем, что он также с высокой частотой транспонируется в один специфический участок бактериальных хромосом, называемый attTn7. [22] Эта специфическая последовательность является важным и высококонсервативным геном, обнаруженным во многих штаммах бактерий. Однако рекомбинация не является вредной для бактерии-хозяина, поскольку Tn7 фактически перемещается ниже гена после его распознавания, что приводит к безопасному способу размножения транспозона без уничтожения хозяина. Этот высокоразвитый и сложный путь выбора сайта-мишени позволяет предположить, что этот путь эволюционировал, чтобы способствовать сосуществованию транспозона и его хозяина, а также успешной передаче Tn7 будущим поколениям бактерий. [21]
Транспозон Tn7 имеет длину 14 т.п.н. и кодирует пять ферментов. [21] Концы последовательности ДНК состоят из двух сегментов, с которыми взаимодействует транспозаза Tn7 во время рекомбинации. Левый сегмент (Tn7-L) имеет длину 150 п.н., а правая последовательность (Tn7-R) — 90 п.н. Оба конца транспозона содержат серию из 22 сайтов связывания, которые транспозаза Tn7 распознает и с которыми связывается. Внутри транспозона находятся пять отдельных генов, кодирующих белки, составляющие механизм транспозиции. Кроме того, транспозон содержит интегрон — сегмент ДНК, содержащий несколько кассет генов, кодирующих устойчивость к антибиотикам. [21]
Транспозон Tn7 кодирует пять белков: TnsA, TnsB, TnsC, TnsD и TnsE. [21] TnsA и TnsB взаимодействуют вместе, образуя фермент транспозазу Tn7 TnsAB. Фермент специфически распознает и связывается с концами последовательности ДНК транспозона и вырезает ее, вводя двухцепочечные разрывы ДНК на каждом конце. Затем вырезанную последовательность встраивают в другой целевой участок ДНК. Как и другие охарактеризованные транспозоны, механизм транспозиции Tn7 включает отщепление 3'-концов донорной ДНК белком TnsA транспозазы TnsAB. Однако Tn7 также уникальным образом расщепляется вблизи 5'-концов, примерно в 5 п.о. от 5'-конца в сторону транспозона Tn7, белком TnsB TnsAB. После вставки транспозона в целевой участок ДНК 3'-концы ковалентно связаны с целевой ДНК, но на 5'-концах все еще присутствуют разрывы в 5 п.н. В результате восстановление этих пробелов приводит к дальнейшей дупликации на 5 п.н. в целевом сайте. Белок TnsC взаимодействует с ферментом транспозазой и целевой ДНК, способствуя процессам вырезания и вставки. Способность TnsC активировать транспозазу зависит от ее взаимодействия с ДНК-мишенью вместе с соответствующим нацеливающим белком, TnsD или TnsE. Белки TnsD и TnsE являются альтернативными селекторами мишеней, которые также связываются с ДНК. активаторы , которые способствуют удалению и вставке Tn7. Их способность взаимодействовать с определенной ДНК-мишенью является ключом к выбору сайта-мишени Tn7. Таким образом, белки TnsA, TnsB и TnsC образуют основной механизм Tn7: TnsA и TnsB взаимодействуют друг с другом, образуя транспозазу, тогда как TnsC действует как регулятор активности транспозазы, обеспечивая связь между транспозазой и TnsD и TnsE. Когда белок TnsE взаимодействует с основным механизмом TnsABC, Tn7 преимущественно направляет вставки в конъюгируемые плазмиды. Когда белок TnsD взаимодействует с TnsABC, Tn7 преимущественно направляет вставки ниже по ходу хода в один важный и высококонсервативный участок бактериальной хромосомы. Этот сайт attTn7 специально признан TnsD. [21]
Ссылки [ править ]
- ^ Хеффрон Ф., Маккарти Б.Дж., Оцубо Х., Оцубо Э. (декабрь 1979 г.). «Анализ последовательности ДНК транспозона Tn3: три гена и три сайта, участвующих в транспозиции Tn3». Клетка . 18 (4): 1153–63. дои : 10.1016/0092-8674(79)90228-9 . ПМИД 391406 . S2CID 17775137 .
- ↑ Перейти обратно: Перейти обратно: а б с Гудселл Д (декабрь 2006 г.). «Транспозаза» . Молекула месяца . Банк данных по белкам.
- ↑ Перейти обратно: Перейти обратно: а б с д и ж г час я дж к л Резников WS (март 2003 г.). «Tn5 как модель понимания транспозиции ДНК» . Молекулярная микробиология . 47 (5): 1199–206. дои : 10.1046/j.1365-2958.2003.03382.x . ПМИД 12603728 .
- ^ Азиз, Р.К., М. Брейтбарт и Р.А. Эдвардс (2010). Транспозазы — наиболее распространенные и повсеместно встречающиеся гены в природе. Исследования нуклеиновых кислот 38 (13): 4207–4217. Азиз Р.К., Брейтбарт М., Эдвардс Р.А. (июль 2010 г.). «Транспозазы — самые распространенные и повсеместно распространенные гены в природе» . Исследования нуклеиновых кислот . 38 (13): 4207–17. дои : 10.1093/nar/gkq140 . ПМК 2910039 . ПМИД 20215432 .
- ^ Макдауэлл Дж. «Транспозаза» . ИнтерПро .
- ↑ Перейти обратно: Перейти обратно: а б Ловелл С., Горышин И.Ю., Резников В.Р., Рэймент I (апрель 2002 г.). «Связывание двух металлов с активным сайтом синаптического комплекса транспозазы Tn5». Структурная биология природы . 9 (4): 278–81. дои : 10.1038/nsb778 . ПМИД 11896402 . S2CID 9721663 .
- ↑ Перейти обратно: Перейти обратно: а б с д Петерсон Г., Резников В. (январь 2003 г.). «Мутации активного сайта транспозазы Tn5 предполагают положение ДНК донорского остова в синаптическом комплексе» . Журнал биологической химии . 278 (3): 1904–9. дои : 10.1074/jbc.M208968200 . ПМИД 12424243 .
- ↑ Перейти обратно: Перейти обратно: а б с Ади, Эндрю (декабрь 2010 г.). «Быстрое создание библиотек фрагментов дробовика с низкими затратами и низким уровнем смещения путем транспозиции высокой плотности in vitro» . Геномная биология . 11 (12): 119 р. дои : 10.1186/gb-2010-11-12-r119 . ПМК 3046479 . ПМИД 21143862 .
- ^ Ивикс, З.; Хакетт, ПБ; Пластерк, РА; Изсвак, З. (1997). «Молекулярная реконструкция Спящей красавицы: Tc1-подобный транспозон рыбы и его транспозиция в клетках человека» . Клетка . 91 (4): 501–510. дои : 10.1016/s0092-8674(00)80436-5 . ПМИД 9390559 .
- ^ Крейг Н.Л. (октябрь 1995 г.). «Единство в реакциях транспозиции». Наука . 270 (5234): 253–4. Бибкод : 1995Sci...270..253C . дои : 10.1126/science.270.5234.253 . ПМИД 7569973 . S2CID 29930180 .
- ^ Несмелова И.В., Хакетт П.Б. (сентябрь 2010 г.). «ДДЕ-транспозазы: структурное сходство и разнообразие» . Обзоры расширенной доставки лекарств . 62 (12): 1187–95. дои : 10.1016/j.addr.2010.06.006 . ПМЦ 2991504 . ПМИД 20615441 .
- ^ Ивикс З., Изсвак З. (январь 2005 г.). «Происходит много всего: новые транспозонные инструменты для функциональной геномики позвоночных». Тенденции в генетике . 21 (1): 8–11. дои : 10.1016/j.tig.2004.11.008 . ПМИД 15680506 .
- ^ Изсвак З., Хакетт П.Б., Купер Л.Дж., Ивикс З. (сентябрь 2010 г.). «Перенос транспозиции «Спящей красавицы» в клеточную терапию: победы и вызовы» . Биоэссе . 32 (9): 756–67. doi : 10.1002/bies.201000027 . ПМК 3971908 . ПМИД 20652893 .
- ^ Аронович, Э.Л., МакИвор, Р.С., и Хакетт, П.Б. (2011). Транспозонная система «Спящая красавица» — невирусный вектор для генной терапии. Хм. Мол. Жене. (в печати) Аронович Э.Л., МакИвор Р.С., Хакетт П.Б. (апрель 2011 г.). «Транспозонная система «Спящей красавицы»: невирусный вектор для генной терапии» . Молекулярная генетика человека . 20 (Р1): Р14-20. дои : 10.1093/hmg/ddr140 . ПМК 3095056 . ПМИД 21459777 .
- ^ Карлсон CM, Ларгаэспада Д.А. (июль 2005 г.). «Инсерционный мутагенез у мышей: новые перспективы и инструменты». Обзоры природы Генетика . 6 (7): 568–80. дои : 10.1038/nrg1638 . ПМИД 15995698 . S2CID 3194633 .
- ^ Коупленд Н.Г., Дженкинс Н.А. (октябрь 2010 г.). «Использование транспозонов для открытия генов рака». Обзоры природы. Рак . 10 (10): 696–706. дои : 10.1038/nrc2916 . ПМИД 20844553 . S2CID 6910577 .
- ^ Матес Л., Чуа М.К., Белай Е., Джерчоу Б., Маной Н., Акоста-Санчес А. и др. (июнь 2009 г.). «Молекулярная эволюция новой гиперактивной транспозазы «Спящей красавицы» обеспечивает надежный стабильный перенос генов у позвоночных». Природная генетика . 41 (6): 753–61. дои : 10.1038/ng.343 . ПМИД 19412179 . S2CID 27373372 .
- ^ Грабундзия И, Ирганг М, Матеш Л, Белай Е, Матрай Дж, Гоголь-Деринг А, Каваками К, Чен В, Руис П, Чуа М.К., ВанденДрисше Т, Изсвак З, Ивиц З (июнь 2010 г.). «Сравнительный анализ векторных систем мобильных элементов в клетках человека» . Молекулярная терапия . 18 (6): 1200–9. дои : 10.1038/mt.2010.47 . ПМЦ 2889740 . ПМИД 20372108 .
- ^ Барт П.Т., Датта Н., Хеджес Р.В., Гринтер, Нью-Джерси (март 1976 г.). «Транспозиция последовательности ДНК, кодирующей устойчивость к триметоприму и стрептомицину, из R483 в другие репликоны» . Журнал бактериологии . 125 (3): 800–810. дои : 10.1128/JB.125.3.800-810.1976 . ПМК 236152 . ПМИД 767328 .
- ^ Барт П.Т., Датта Н. (сентябрь 1977 г.). «Два встречающихся в природе транспозона, неотличимых от Tn7» . Журнал общей микробиологии . 102 (1): 129–134. дои : 10.1099/00221287-102-1-129 . ПМИД 915473 .
- ↑ Перейти обратно: Перейти обратно: а б с д и ж Питерс Дж., Крейг Н.Л. (ноябрь 2001 г.). «Tn7: умнее, чем мы думали». Nature Reviews Молекулярно-клеточная биология . 2 (11): 806–814. дои : 10.1038/35099006 . ПМИД 11715047 . S2CID 34733892 .
- ^ Грингауз Э., Орл К.А., Уодделл К.С., Крейг Н.Л. (июнь 1988 г.). «Распознавание attTn7 Escherichia coli транспозоном Tn7: отсутствие требований к конкретной последовательности в точке вставки Tn7» . Журнал бактериологии . 170 (6): 2832–2840. дои : 10.1128/jb.170.6.2832-2840.1988 . ПМК 211210 . ПМИД 2836374 .
Внешние ссылки [ править ]
- Транспозазы Национальной медицинской библиотеки США в медицинских предметных рубриках (MeSH)
- Обзор всей структурной информации, доступной в PDB для UniProt : Q46731 (Транпозаза для транспозона Tn5) в PDBe-KB .
