Транспозон Tn3
Транспозон Tn3 из 4957 пар оснований представляет собой мобильный генетический элемент , обнаруженный у прокариот . Он кодирует три белка:
- β-лактамазы , фермент, который придает устойчивость к β-лактамным антибиотикам (и кодируется геном bla ).
- Tn3 Транспозаза (кодируется геном tnpA )
- Tn3- резольваза (кодируется геном tnpR )
Tn3 является примером репликативного транспозона (транспозона типа Copy-Paste).
Первоначально обнаруженная как репрессор транспозазы, резолваза также играет роль в облегчении репликации Tn3 (Sherratt 1989).
Транспозон окружен парой инвертированных повторов длиной 38 п.н.
Механизм репликации
[ редактировать ]
Шаг 1 – Репликативная интеграция
[ редактировать ]Этот первый этап катализируется транспозазой.
Плазмида, содержащая транспозон (донорская плазмида), сливается с плазмидой хозяина (целевая плазмида). При этом транспозон и короткий участок ДНК хозяина реплицируются. Конечный продукт представляет собой «коинтегрированную» плазмиду, содержащую две копии транспозона.
Шапиро (1978) [ 1 ] предложил следующий механизм этого процесса:
- Происходят четыре одноцепочечных расщепления – по одному на каждой цепи донорной плазмиды и по одному на каждой цепи целевой плазмиды.
- Донорская и целевая плазмиды лигируются вместе, но из-за расположения исходных расщеплений остаются две одноцепочечные области.
- Репликация ДНК делает одноцепочечные области двухцепочечными, используя существующую цепь в качестве матрицы. Именно на этой стадии транспозон реплицируется.
Примечание. Диаграмма не предназначена для точного представления трехмерной структуры.
Диаграммы справа иллюстрируют, каким образом расположение расщеплений приводит к репликации определенных областей после слияния плазмид.
Шаг 2 – Разрешение
[ редактировать ]
Чтобы разделить молекулы-хозяина и молекулы-мишени, резолваза Tn3 выполняет сайт-специфическую рекомбинацию между старой и новой копией транспозона в определенном сайте, называемом res , который присутствует в каждой копии транспозона. Res имеет длину 114 п.н. и состоит из 3 субсайтов, а именно сайтов I, II и III. Каждый из этих сайтов имеет разную длину (28, 34 и 25 п.н. соответственно) и они расположены неравномерно: 22 п.н. разделяют сайты I и II и только 5 п.н. между сайтами II и III. Сайты состоят из инвертированных повторяющихся мотивов длиной 6 п.н., фланкирующих центральную последовательность переменной длины. Эти мотивы действуют как сайты связывания для резолвазы, так что каждый сайт связывает димер резольвазы, но с различной аффинностью и, вероятно, немного другой архитектурой комплекса белок-ДНК. [ 2 ] [ 3 ] Все три подсайта необходимы для рекомбинации.
При рекомбинации два напрямую повторяющихся сайта res с димерами резольвазы, связанными с каждым субсайтом, собираются вместе, образуя большую сложную структуру, называемую синаптосомой. Резольваза, связывающаяся с сайтами II и III, инициирует сборку этого комплекса. В этой структуре, точная архитектура которой до сих пор неясна, два сайта res переплетаются таким образом, что сопоставляют две копии сайта I, позволяя димерам резольвазы, связанным с каждым сайтом, образовывать тетрамер. Опять же, именно взаимодействие между димерами резольвазы, связанными в дополнительных сайтах (сайты II и III), и резольвазой в сайте I заставляет два димера синапсироваться и образовывать тетрамер. После образования тетрамера он активируется, и верхняя и нижняя цепи ДНК одновременно расщепляются в середине сайта I с выступом в 2 п.о. Обмен нитей происходит по пока неизвестному механизму, в результате чего происходит поворот на 180°. За обменом цепей затем следует повторное лигирование (Stark et al., 1992). Рекомбинация между двумя напрямую повторяющимися сайтами res разделяет или разделяет «коинтеграцию» на две исходные молекулы, каждая из которых теперь содержит копию транспозона Tn3. После разделения эти две молекулы остаются связанными в виде простого двухузлового катенана, который можно легко разделить. in vivo типа II топоизомеразой (Grindley 2002). Резолвазная система дикого типа абсолютно требует сверхспирального субстрата и того, чтобы сайты рекомбинации были ориентированы в виде прямого повтора на одной и той же молекуле ДНК. Однако был изолирован ряд «дерегулированных» или «гиперактивных» мутантов, которые утратили потребность в дополнительных сайтах. Эти мутанты способны катализировать рекомбинацию только между двумя копиями сайта I, что фактически уменьшает размер сайта рекомбинации со 114 п.н. до всего лишь 28 п.н. [ 4 ] [ 5 ] Более того, эти мутанты не имеют требований к сверхспирализации или связности (Arnold et al., 1999) и, как было показано, работают в клетках млекопитающих. [ 6 ] Гиперактивные мутанты резольвазы до сих пор оказались полезными для создания резольваз с измененной специфичностью последовательности. [ 7 ] но и в структурной работе. [ 8 ]
Вся реакция рекомбинации резольвазы может быть воспроизведена in vitro , для чего требуется только резольваза, ДНК-субстрат и многовалентные катионы, используя либо белок дикого типа, либо гиперактивные мутанты. [ 4 ] [ 9 ]
Гиперактивные мутанты резольвазы, если они будут развиваться дальше, могут стать альтернативой Cre и FLP , наиболее часто используемым на сегодняшний день рекомбинационным системам в молекулярной биологии.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Шапиро, Джеймс (апрель 1979 г.). «Молекулярная модель транспозиции и репликации бактериофага Мю и других мобильных элементов» . ПНАС . 76 (4): 1933–1937. Бибкод : 1979ПНАС...76.1933С . дои : 10.1073/pnas.76.4.1933 . ПМЦ 383507 . ПМИД 287033 .
- ^ Абдель-Мегид СС, Гриндли Н.Д., Темплтон Н.С., Стейц Т.А. (апрель 1984 г.). «Расщепление сайт-специфического рекомбинационного белка гамма-дельта-резольвазы: меньший из двух фрагментов специфически связывает ДНК» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 81 (7): 2001–5. Бибкод : 1984ПНАС...81.2001А . дои : 10.1073/pnas.81.7.2001 . ПМЦ 345424 . ПМИД 6326096 .
- ^ Блейк Д.Г., Букок М.Р., Шерратт Д.Д., Старк В.М. (сентябрь 1995 г.). «Кооперативное связывание мономеров резольвазы Tn3 с функционально асимметричным сайтом связывания» . Курс. Биол . 5 (9): 1036–46. дои : 10.1016/S0960-9822(95)00208-9 . ПМИД 8542280 .
- ^ Jump up to: а б Арнольд П.Х., Блейк Д.Г., Гриндли Н.Д., Букок М.Р., Старк В.М. (март 1999 г.). «Мутанты резольвазы Tn3, которым не требуются дополнительные сайты связывания для рекомбинационной активности» . ЭМБО Дж . 18 (5): 1407–14. дои : 10.1093/emboj/18.5.1407 . ПМЦ 1171230 . ПМИД 10064606 .
- ^ Берк М.Э., Арнольд П.Х., Хе Дж. и др. (февраль 2004 г.). «Активирующие мутации интерфейсов маркировки резольвазы Tn3, важные для катализа рекомбинации и его регуляции». Мол. Микробиол . 51 (4): 937–48. дои : 10.1046/j.1365-2958.2003.03831.x . ПМИД 14763971 .
- ^ Швикарди М., Дрёге П. (апрель 2000 г.). «Сайт-специфическая рекомбинация в клетках млекопитающих, катализируемая мутантами гаммадельта-резольвазы: значение для топологии эписомальной ДНК» . ФЭБС Летт . 471 (2–3): 147–50. дои : 10.1016/S0014-5793(00)01394-6 . ПМИД 10767411 . S2CID 83750793 .
- ^ Акопян А., Хе Дж., Букок М.Р., Старк В.М. (июль 2003 г.). «Химерные рекомбиназы с разработанным распознаванием последовательностей ДНК» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 100 (15): 8688–91. Бибкод : 2003PNAS..100.8688A . дои : 10.1073/pnas.1533177100 . ПМК 166373 . ПМИД 12837939 .
- ^ Ли В., Камтекар С., Сюн Й., Саркис Г.Дж., Гриндли Н.Д., Стейц Т.А. (август 2005 г.). «Структура синаптического тетрамера гаммадельта-резольвазы, ковалентно связанного с двумя расщепленными ДНК». Наука . 309 (5738): 1210–5. Бибкод : 2005Sci...309.1210L . дои : 10.1126/science.1112064 . ПМИД 15994378 . S2CID 84409916 .
- ^ Рид Р.Р., Гриндли Н.Д. (сентябрь 1981 г.). «Транспозон-опосредованная сайт-специфическая рекомбинация in vitro: расщепление ДНК и связь белок-ДНК в сайте рекомбинации». Клетка . 25 (3): 721–8. дои : 10.1016/0092-8674(81)90179-3 . ПМИД 6269756 . S2CID 28410571 .
- Шерратт, диджей (1989). Tn3 и родственные мобильные элементы: сайт-специфическая рекомбинация и транспозиция. Берг, Д.Э., Хоу, М. (ред.) Мобильная ДНК. Американское общество микробиологии, Вашингтон, округ Колумбия, стр. 163–184.
- Гриндли, NDF (2002). Движение Tn3-подобных элементов: транспозиция и коинтегративное разрешение. В Mobile DNA II, Крейг Н., Крейги Р., Геллерт М. и Ламбовиц А. (ред.), стр. 272–302. ASM Press, Вашингтон, округ Колумбия, США