Транспозоны как генетический инструмент

Транспозоны представляют собой полупаразитарные последовательности ДНК хозяина , которые могут реплицироваться и распространяться по геному . Их можно использовать в качестве генетического инструмента для анализа функций генов и белков . Использование транспозонов хорошо развито у дрозофилы (у которой Р-элементы чаще всего используются ), а также у кресс-салата ( Arabidopsis thaliana ) и таких бактерий, как Escherichia coli ( E. coli ). ^{[ 1 ]}^{[ 2 ]}

В настоящее время транспозоны могут быть использованы в генетических исследованиях и рекомбинантной генной инженерии для инсерционного мутагенеза . Инсерционный мутагенез – это когда транспозоны действуют как векторы , помогая удалять и интегрировать генетические последовательности. Учитывая их относительно простую конструкцию и присущую им способность перемещать последовательности ДНК, транспозоны очень совместимы при преобразовании генетического материала, что делает их идеальными генетическими инструментами.

Сигнатурный мутагенез

Мутагенез с сигнатурной маркировкой (также известный как STM) — это метод, основанный на использовании вставки мобильных элементов для определения фенотипа локуса в геноме организма. Хотя методы генетического секвенирования могут определить генотип генома, они не могут определить функцию или фенотипическую экспрессию последовательностей генов. ^{[ 3 ]}^{[ 4 ]} STM может обойти эту проблему, мутировав локус, заставляя его сформировать новый фенотип; сравнивая наблюдаемые фенотипические проявления мутированного и неизмененного локуса, можно сделать вывод о фенотипическом проявлении локуса.

При СТМ специально помеченные транспозоны встраиваются в организм, например в бактерию, и случайным образом интегрируются в геном хозяина. Теоретически модифицированный мутантный организм должен экспрессировать измененный ген, изменяя тем самым фенотип. Если наблюдается новый фенотип, геном секвенируют и ищут меченые транспозоны. ^{[ 3 ]} Если место интеграции транспозона обнаружено, то этот локус может быть ответственным за выражение фенотипов. ^{[ 5 ]}^{[ 6 ]}

Было проведено множество исследований СТМ на основе транспозонов, особенно с P-элементами. ^{[ 4 ]} у дрозофилы . P-элементы представляют собой транспозоны, первоначально описанные в геноме Drosophila melanogaster , которые можно искусственно синтезировать или распространять на другие виды Drosophila посредством горизонтального переноса. ^{[ 4 ]} встраивают искусственно созданные Р-элементы и гены транспозаз В экспериментальных испытаниях в геномы эмбрионов дрозофилы . Впоследствии геномы эмбрионов, у которых наблюдаются мутации, секвенируют и сравнивают, таким образом выявляя локусы, на которые повлияла вставка, и роль этих локусов. ^{[ 4 ]}^{[ 6 ]}

Инсерционная инактивация

Инсерционная инактивация направлена на подавление экспрессии гена путем нарушения его последовательности вставкой. Когда дополнительные нуклеотиды вставляются рядом или в локус, этот локус может подвергнуться мутации сдвига рамки считывания , которая может помешать его правильной экспрессии в полипептидную цепь . Инсерционная инактивация на основе транспозонов рассматривается в медицинских исследованиях: от подавления устойчивости бактерий к антибиотикам до лечения генетических заболеваний . ^{[ 7 ]} При лечении генетических заболеваний вставка транспозона в вредоносный генный локус генома организма приведет к смещению последовательности локуса, усекая любые образующиеся вредные белки и делая их нефункциональными. В качестве альтернативы можно использовать инсерционную инактивацию для подавления генов, которые выражают устойчивость бактерий к антибиотикам. ^{[ 7 ]}^{[ 8 ]}

Спящая красавица

Хотя транспозоны успешно использовались у растений и беспозвоночных посредством инсерционного мутагенеза и инсерционной активации, использование транспозонов у позвоночных было ограничено из-за отсутствия транспозонов, специфичных для позвоночных. Почти все транспозоны, совместимые с геномами позвоночных и присутствующие в них, неактивны и часто относят их к «мусорной» ДНК. ^{[ 6 ]} Однако возможно идентифицировать спящие транспозоны и искусственно воссоздать их в качестве активных агентов. ^{[ 6 ]} Исследователи-генетики Жужанна Изсвак и Золтан Ивикс обнаружили последовательность транспозона рыбы, которая, несмотря на то, что находилась в состоянии покоя в течение 15 миллионов лет, может быть воскрешена в качестве вектора для внедрения чужеродных генов в геномы позвоночных, в том числе человека. Этот транспозон, получивший название «Спящая красавица», был описан в 1997 году, и его можно было искусственно реактивировать в функционирующий транспозон. ^{[ 6 ]}

«Спящая красавица» также может быть применима в процедурах генной терапии, помогая внедрять полезные трансгены в геномы хозяина. Белчер и др. проверили эту идею, используя транспозоны «Спящей красавицы», чтобы помочь вставить последовательности мышам с серповидноклеточной анемией, чтобы они могли производить ферменты, необходимые для противодействия анемии. ^{[ 6 ]} Белчер и др. начали свой эксперимент с создания генетической последовательности, состоящей из мобильного элемента Hmox-1 и транспозазы Спящей красавицы. Эту последовательность затем добавляли, встраивали в плазмиду и вводили в клетки мышей. Транспозаза из «Спящей красавицы» помогла внедрить транспозон Hmox-1 в геном мышей, что позволило производить фермент гемоксигеназу-1 (HO-1). У мышей, получивших вставку, наблюдалось пятикратное увеличение экспрессии HO-1, что, в свою очередь, уменьшало закупорку кровеносных сосудов из-за серповидноклеточной анемии. Публикация эксперимента в 2010 году показала, что транспозоны могут быть полезны в генной терапии. ^{[ 6 ]}

P Elements как инструмент ( Дрозофила )

Встречающиеся в природе элементы P содержат:

кодирующая последовательность фермента транспозазы ;
последовательности распознавания действия транспозазы.

Транспозаза — это фермент, который регулирует и катализирует удаление элемента P из ДНК хозяина, разрезая два сайта узнавания, а затем случайным образом повторно вставляя элемент P. Это процесс случайной вставки, который может влиять на существующие гены или нести дополнительный ген, который можно использовать в качестве процесса генетических исследований.

Чтобы использовать этот процесс в качестве полезного и контролируемого генетического инструмента, две части элемента P необходимо разделить, чтобы предотвратить неконтролируемую транспозицию. Таким образом, нормальными генетическими инструментами являются:

ДНК, кодирующая транспозазу (или иногда просто транспозазу), без последовательностей распознавания транспозазы, поэтому она не может вставляться; и
«P-плазмида».

P Плазмиды всегда содержат:

репортерный ген дрозофилы , часто маркер красных глаз (продукт белого гена);
последовательности распознавания транспозазы;

и может содержать:

ген интереса;
репортерный ген E. coli (часто некий вид устойчивости к антибиотикам ); и
начало репликации и другие связанные с ним плазмиды . последовательности «домашнего хозяйства»

Способы применения ( Дрозофила )

(методы прямой генетики) Существует два основных способа использования этих инструментов: трансформация мух и инсерционный мутагенез, каждый из которых описан ниже.

Летающая трансформация

(надеюсь на вставку в некодирующие регионы)

Микроинъецируйте на ранней стадии (прецеллюляризация) задний конец эмбриона , кодирующего транспозазу , и плазмиду с репортерным геном, представляющим интерес геном и последовательностями распознавания транспозазы.
Происходит случайная транспозиция, включающая интересующий ген и репортерный ген.
Выращивайте мух и скрещивайте их, чтобы устранить генетические различия между клетками организма. (Только некоторые клетки организма будут трансформированы. При скрещивании передается только генотип гамет, устраняя эту вариацию).
Ищите мух, экспрессирующих репортерный ген. Они несут встроенный интересующий ген, поэтому их можно исследовать для определения фенотипа интересующего гена.

Важно отметить, что вставленный ген мог повредить функцию одного из генов хозяина. Требуется несколько линий мух, чтобы можно было провести сравнение и убедиться, что никакие дополнительные гены не были выбиты.

Инсерционный мутагенез

(надеюсь на вставку в регион кодирования)

Микроинъецируйте эмбрион, кодирующий транспозазу, и плазмиду с репортерным геном и последовательностями распознавания транспозазы (а часто и репортерный ген E. coli , точку начала репликации и т. д.).
Происходит случайная транспозиция, при которой репортерный ген вставляется случайным образом. Вставка имеет тенденцию происходить вблизи активно транскрибируемых генов, поскольку именно здесь структура хроматина наиболее рыхлая, а значит, ДНК наиболее доступна.
Выращивайте мух и скрещивайте их, чтобы устранить генетические различия между клетками организма (см. выше).
Ищите мух, экспрессирующих репортерный ген. Они прошли успешную транспозицию, поэтому их можно исследовать для определения фенотипа из-за мутации существующих генов.

Возможные мутации:

Вставка в транслируемую область => гибридный белок/усеченный белок. Обычно вызывает потерю функции белка, хотя наблюдаются и более сложные эффекты.
Вставка в интрон => измененный паттерн сплайсинга /ошибка сплайсинга. Обычно это приводит к усечению белка или образованию неактивных продуктов неправильного сплайсинга, хотя распространены и более сложные эффекты.
Вставка в 5'-нетранслируемую область (последовательность, которая станет 5'-UTR мРНК) => усечение транскрипта. Обычно это приводит к тому, что мРНК не содержит 5'-кэпа , что приводит к менее эффективной трансляции.
Вставка в промотор => снижение/полная потеря экспрессии. Всегда приводит к значительному снижению уровня производства белка. Самый полезный тип вставки для анализа из-за простоты ситуации.
Вставка между промотором и вышестоящими энхансерами => потеря функции энхансера/нарушение функции энхансера репортерного гена.† Обычно снижает уровень специфичности белка к типу клеток, хотя часто наблюдаются сложные эффекты.

† Захват усилителя

Захват энхансера другого гена позволяет проанализировать функцию этого энхансера. Это, особенно если репортерный ген предназначен для флуоресцентного белка, может быть использовано для картирования экспрессии мутировавшего гена в организме и является очень мощным инструментом.

Другое использование элементов P ( дрозофила )

(метод обратной генетики)

Вторичная мобилизация

Если рядом с интересующим геном есть старый элемент P (с сломанной транспозазой), вы можете ремобилизовать его путем микроинъекции эмбриона с кодированием транспозазы или самой транспозазы. Элемент P часто перемещается в пределах нескольких тысяч оснований от исходного местоположения, что, возможно, повлияет на интересующий вас ген в случае «инсерционного мутагенеза».

Анализ продуктов мутагенеза ( дрозофилы )

После определения функции мутированного белка можно секвенировать/очистить/клонировать области, фланкирующие вставку, следующими методами:

Обратная ПЦР

Изолировать геном мухи.
Провести легкий перевар (с использованием фермента [фермента 1], который, как известно, НЕ разрезает репортерный ген), получив фрагменты в несколько тысяч оснований, некоторые со вставкой и фланкирующей ДНК.
Самолигируйте гидролизат (низкая концентрация ДНК для обеспечения самолигирования), получая выборку кольцевых фрагментов ДНК, некоторые из которых содержат вставку и фланкирующую ее ДНК.
Разрежьте плазмиды в какой-то точке репортерного гена (с помощью фермента [фермента 2], который, как известно, очень редко разрезает геномную ДНК, но известен в репортерном гене).
Используя праймеры для участков репортерного гена, ДНК можно амплифицировать для секвенирования .

Процесс разрезания, самолигирования и повторного разрезания позволяет амплифицировать фланкирующие области ДНК без знания последовательности. Точку, в которой произошло лигирование, можно увидеть, определив место разреза [фермента 1].

Спасение плазмиды ( трансформация E. coli )

Изолировать геном мухи.
Провести легкий перевар (с использованием фермента [фермента 1], который, как известно, разрезает границу между репортерным геном и репортерным геном E. coli и последовательностями плазмиды), давая фрагменты в несколько тысяч оснований, некоторые с репортером E. coli , плазмидные последовательности и фланкирующая их ДНК.
Самолигируйте гидролизат (низкая концентрация ДНК для обеспечения самолигирования), получая выборку кольцевых фрагментов ДНК, некоторые из которых содержат репортер E. coli , плазмидные последовательности и фланкирующую их ДНК.
Вставьте плазмиды в клетки E. coli (например, электропорацией).
Скрининг плазмид на репортерный ген E. coli. Только успешные вставки плазмид с последовательностями «домашнего хозяйства» плазмиды будут экспрессировать этот ген.

7. Ген можно клонировать для дальнейшего анализа.

Применение мобильных элементов Другие организмы

Аналогичным образом можно проанализировать геномы других организмов, хотя и с другими мобильными элементами. Недавнее открытие «транспозона Mariner » (в результате реконструкции исходной последовательности из многих «мертвых» версий в геноме человека) позволило провести множество новых экспериментов. Mariner имеет хорошо консервативные гомологи у широкого круга видов и является очень универсальным транспозоном. инструмент.

Ссылки

Эта статья включает в себя материал из статьи Citizendium « Транпозоны как генетический инструмент », которая лицензируется по лицензии Creative Commons Attribution-ShareAlike 3.0 Unported License , но не по GFDL .

^ Беквит, Дж.; Силхави, Ти Джей (1992). Сила бактериальной генетики: литературный курс . Нью-Йорк: Лабораторное издательство Колд-Спринг-Харбор. стр. 555–614. ISBN 0-87969-411-4 .
^ Клекнер Н., Рот Дж., Ботштейн Д. (октябрь 1977 г.). «Генная инженерия in vivo с использованием транслоцируемых элементов лекарственной устойчивости. Новые методы генетики бактерий». Дж. Мол. Биол . 116 (1): 125–59. дои : 10.1016/0022-2836(77)90123-1 . ПМИД 338917 .
^ Jump up to: ^а ^б Берг, Клэр; Берг, Дуглас Э. «Инструменты мобильных элементов для микробной генетики» . ЭкоСал.
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д Энгельс, Уильям Р. «P-элементы у дрозофилы» . Кафедра генетики Университета Висконсина. Архивировано из оригинала 11 января 2006 г.
^ Ивикс З., Ли М.А., Матес Л. и др. (июнь 2009 г.). «Транспозон-опосредованное манипулирование геномом у позвоночных» . Нат. Методы . 6 (6): 415–22. дои : 10.1038/nmeth.1332 . ПМК 2867038 . ПМИД 19478801 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г Люфт ФК (июль 2010 г.). «Спящая красавица прыгает на новую высоту» . Дж. Мол. Мед . 88 (7): 641–3. дои : 10.1007/s00109-010-0626-1 . ПМИД 20467721 .
^ Jump up to: ^а ^б Бергер-Бечи Б. (апрель 1983 г.). «Инсерционная инактивация устойчивости стафилококка к метициллину с помощью Tn551» . Дж. Бактериол . 154 (1): 479–87. ПМК 217482 . ПМИД 6300037 .
^ Золтана Ивичс; Мэн Эми Ли; Лайош Матеш; Джеф Д. Буке; Аллан Брэдли (июнь 2009 г.). «Транспозон-опосредованные манипуляции с геномом у позвоночных» . Нат. Методы . 6 (6): 415–22. дои : 10.1038/nmeth.1332 . ПМК 2867038 . ПМИД 19478801 .

Дальнейшее чтение

Снайдер, Л.; Чампнесс, В. (2003). «Глава 9: Транспозиция и сайт-специфическая рекомбинация». Молекулярная генетика бактерий (2-е изд.). Вашингтон, округ Колумбия: ASM Press. стр. 303–340 . ISBN 1-55581-204-Х .
«Библиография: Транспозоны как генетический инструмент» . Citizendium.org.
Мартиенссен, РА; Спрингер, П.С. «Мутагенез транспозонов с усилителями и генными ловушками у арабидопсиса» . Лаборатория Колд-Спринг-Харбор.

[1] Беквит, Дж.; Силхави, Ти Джей (1992). Сила бактериальной генетики: литературный курс . Нью-Йорк: Лабораторное издательство Колд-Спринг-Харбор. стр. 555–614. ISBN 0-87969-411-4 .

[2] Клекнер Н., Рот Дж., Ботштейн Д. (октябрь 1977 г.). «Генная инженерия in vivo с использованием транслоцируемых элементов лекарственной устойчивости. Новые методы генетики бактерий». Дж. Мол. Биол . 116 (1): 125–59. дои : 10.1016/0022-2836(77)90123-1 . ПМИД 338917 .

[Berg-3] Jump up to: ^а ^б Берг, Клэр; Берг, Дуглас Э. «Инструменты мобильных элементов для микробной генетики» . ЭкоСал.

[Engels-4] Jump up to: ^а ^б ^с ^д Энгельс, Уильям Р. «P-элементы у дрозофилы» . Кафедра генетики Университета Висконсина. Архивировано из оригинала 11 января 2006 г.

[5] Ивикс З., Ли М.А., Матес Л. и др. (июнь 2009 г.). «Транспозон-опосредованное манипулирование геномом у позвоночных» . Нат. Методы . 6 (6): 415–22. дои : 10.1038/nmeth.1332 . ПМК 2867038 . ПМИД 19478801 .

[Luft10-6] Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г Люфт ФК (июль 2010 г.). «Спящая красавица прыгает на новую высоту» . Дж. Мол. Мед . 88 (7): 641–3. дои : 10.1007/s00109-010-0626-1 . ПМИД 20467721 .

[Berger83-7] Jump up to: ^а ^б Бергер-Бечи Б. (апрель 1983 г.). «Инсерционная инактивация устойчивости стафилококка к метициллину с помощью Tn551» . Дж. Бактериол . 154 (1): 479–87. ПМК 217482 . ПМИД 6300037 .

[8] Золтана Ивичс; Мэн Эми Ли; Лайош Матеш; Джеф Д. Буке; Аллан Брэдли (июнь 2009 г.). «Транспозон-опосредованные манипуляции с геномом у позвоночных» . Нат. Методы . 6 (6): 415–22. дои : 10.1038/nmeth.1332 . ПМК 2867038 . ПМИД 19478801 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]