Обратная полимеразная цепная реакция
 | Эта статья включает список общих ссылок , но в ней отсутствуют достаточные соответствующие встроенные цитаты . ( Апрель 2012 г. ) |
Обратная полимеразная цепная реакция ( обратная ПЦР ) — это вариант полимеразной цепной реакции , который используется для амплификации ДНК только с одной известной последовательностью. Одним из ограничений традиционной ПЦР является то, что для нее требуются праймеры, комплементарные обоим концам целевой ДНК, но этот метод позволяет проводить ПЦР, даже если доступна только одна последовательность, из которой можно сконструировать праймеры.
Обратная ПЦР особенно полезна для определения мест вставки . Например, различные ретровирусы и транспозоны случайным образом интегрируются в геномную ДНК . [ 1 ] Чтобы идентифицировать сайты, куда они проникли, можно использовать известные «внутренние» вирусные или транспозонные последовательности для создания праймеров, которые будут амплифицировать небольшую часть фланкирующей «внешней» геномной ДНК. Затем амплифицированный продукт можно секвенировать и сравнить с базами данных ДНК, чтобы определить местонахождение нарушенной последовательности.
Метод обратной ПЦР включает серию рестрикционных расщеплений и лигирование , в результате чего образуется петлевой фрагмент, который можно использовать для ПЦР из одного участка известной последовательности. Затем, как и в других процессах полимеразной цепной реакции, ДНК амплифицируется термостабильной ДНК-полимеразой :
- Идентифицирован целевой регион с внутренним участком известной последовательности и неизвестными фланкирующими областями.
- Геномная ДНК расщепляется на фрагменты размером в несколько тысяч оснований с низкой и средней частотой (6-8 оснований) обычно с помощью расщепляющего рестрикционного фермента .
- При низких концентрациях ДНК или условиях быстрого лигирования индуцируется самолигирование с образованием кольцевого продукта ДНК.
- ПЦР проводят, как обычно, с использованием кольцевой матрицы с праймерами, комплементарными участкам известной внутренней последовательности, направленными наружу.
Наконец, последовательность секвенированного продукта ПЦР сравнивается с базами данных последовательностей. Применяется при ползании хромосом.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Охман, Х.; Гербер, А.С.; Хартл, Д.Л. (1 ноября 1988 г.). «Генетическое применение обратной полимеразной цепной реакции» . Генетика . 120 (3): 621–623. дои : 10.1093/генетика/120.3.621 . ISSN 0016-6731 . ПМЦ 1203539 . ПМИД 2852134 .
