Случайная амплификация полиморфной ДНК

Случайно амплифицированная полиморфная ДНК ( RAPD ), произносится как «быстрая», представляет собой тип полимеразной цепной реакции (ПЦР), но амплифицируемые сегменты ДНК являются случайными. Ученый, выполняющий RAPD, создает несколько произвольных коротких праймеров (10–12 нуклеотидов), затем приступает к ПЦР с использованием большой матрицы геномной ДНК в надежде, что фрагменты будут амплифицироваться. Разрешив полученные закономерности, можно получить полууникальный профиль реакции RAPD.

Никакого знания последовательности ДНК целевого генома не требуется, поскольку праймеры будут связываться где-то в последовательности, но неизвестно, где именно. Это делает метод популярным для сравнения ДНК биологических систем, не привлекших внимания научного сообщества, или в системе, в которой сравнивается относительно небольшое количество последовательностей ДНК (он не пригоден для формирования банка данных кДНК). Поскольку он основан на большой, неповрежденной матричной последовательности ДНК, он имеет некоторые ограничения в использовании деградированных образцов ДНК. Его разрешающая способность намного ниже, чем у целевых, видоспецифичных методов сравнения ДНК, таких как короткие тандемные повторы . В последние годы RAPD использовался для характеристики и отслеживания филогении различных видов растений и животных.

Введение

Маркеры RAPD представляют собой декамерные (длиной 10 нуклеотидов) фрагменты ДНК, полученные в результате ПЦР-амплификации случайных сегментов геномной ДНК с одним праймером с произвольной нуклеотидной последовательностью и способные различать генетически различные индивидуумы, хотя и не обязательно воспроизводимым способом.Он используется для анализа генетического разнообразия человека с использованием случайных праймеров. Из-за проблем с воспроизводимостью экспериментов многие научные журналы больше не принимают эксперименты, основанные только на RAPD.RAPD требует только одного праймера для амплификации.

Как это работает

После амплификации с помощью ПЦР образцы загружают в гель (агарозный или полиакриламидный) для гель-электрофореза . Различные размеры, созданные в результате случайной амплификации, будут разделяться по гелю повторяемым образом в зависимости от источника образца. Это создает отчетливый отпечаток ДНК.

В отличие от традиционного ПЦР-анализа, RAPD не требует каких-либо конкретных знаний о последовательности ДНК целевого организма: идентичные 10-мерные праймеры будут или не будут амплифицировать сегмент ДНК, в зависимости от положений, которые комплементарны последовательности праймеров. Например, фрагмент не образуется, если праймеры отожжены слишком далеко друг от друга или 3'-концы праймеров не обращены друг к другу. Следовательно, если в матричной ДНК произошла мутация в сайте, который ранее был комплементарен праймеру, продукт ПЦР не будет получен, что приведет к другому паттерну амплифицированных сегментов ДНК на геле.

Ограничения

• Почти все маркеры RAPD являются доминантными, т.е. невозможно отличить, амплифицируется ли сегмент ДНК из локуса, который является гетерозиготным (1 копия) или гомозиготным (2 копии). Кодоминантные RAPD-маркеры, наблюдаемые как сегменты ДНК разного размера, амплифицированные из одного и того же локуса, обнаруживаются лишь изредка.
• ПЦР является ферментативной реакцией, поэтому качество и концентрация матричной ДНК, концентрации компонентов ПЦР и условия цикла ПЦР могут сильно влиять на результат. Таким образом, метод RAPD, как известно, зависит от лаборатории и требует тщательно разработанных лабораторных протоколов, чтобы его можно было воспроизвести.
• Несоответствие между праймером и матрицей может привести к полному отсутствию продукта ПЦР, а также к простому уменьшению количества продукта. Таким образом, результаты RAPD могут быть трудными для интерпретации, в отличие от традиционного анализа ПЦР.

См. также

• Расщепленная амплифицированная полиморфная последовательность
• Генетический маркер

Внешние ссылки

• RAPD+Technique в Национальной медицинской библиотеке США по медицинским предметным рубрикам (MeSH)