ХОЛОДНАЯ ПЦР
ХОЛОД-ПЦР ( совместная амплификация при температуре более низкой ПЦР денатурации ) представляет собой модифицированный протокол полимеразной цепной реакции (ПЦР), который обогащает варианты аллелей из смеси ДНК дикого типа и мутации , содержащей ДНК . Способность преимущественно амплифицировать и идентифицировать миноритарные аллели и соматические мутации ДНК низкого уровня в присутствии избыточных аллелей дикого типа полезна для обнаружения мутаций. Обнаружение мутаций важно в случае раннего выявления рака по тканей биоптатам и жидкостей организма, таких как плазма или сыворотка крови , оценка остаточного заболевания после операции или химиотерапии , определение стадии заболевания и молекулярное профилирование для прогноза или подбора терапии для отдельных пациентов, а также мониторинг. результатов терапии и ремиссии или рецидива рака. Обычная ПЦР будет амплифицировать как основные (дикий тип), так и минорные (мутантные) аллели с одинаковой эффективностью, лишая возможности легко обнаружить наличие мутаций низкого уровня. Возможность обнаружить мутацию в смеси вариантов ДНК и ДНК дикого типа ценна, поскольку такая смесь вариантов ДНК может возникнуть при использовании гетерогенного образца – как это часто бывает при биопсии рака. В настоящее время традиционная ПЦР используется в тандеме с рядом различных последующих анализов для генотипирование или выявление соматических мутаций. Они могут включать использование амплифицированной ДНК для анализа RFLP , генотипирования MALDI-TOF (матричная лазерная десорбция – время пролета) или прямое секвенирование для обнаружения мутаций с помощью секвенирования по Сэнгеру или пиросеквенирования . Замена традиционной ПЦР на ХОЛОДНУЮ ПЦР для этих последующих анализов повысит надежность обнаружения мутаций в смешанных образцах, включая опухоли и жидкости организма.
Обзоры методов
[ редактировать ]
Основной принцип ХОЛОД-ПЦР заключается в том, что несовпадения отдельных нуклеотидов слегка изменяют температуру плавления (Tm) двухцепочечной ДНК. В зависимости от контекста последовательности и положения несоответствия изменения Tm на 0,2–1,5 °C (0,36–2,7 °F) являются обычными для последовательностей длиной до 200 пар оснований или выше. Зная это, авторы протокола воспользовались двумя наблюдениями:
- Каждая двухцепочечная ДНК имеет «критическую температуру» (Tc) ниже, чем ее Tm. Эффективность ПЦР-амплификации падает заметно ниже Tc.
- Tc зависит от последовательности ДНК. Два фрагмента матричной ДНК, отличающиеся только одним или двумя несовпадениями нуклеотидов, будут иметь разную эффективность амплификации, если этап денатурации ПЦР установлен на Tc.
Принимая во внимание эти принципы, авторы разработали следующий общий протокол:
- Стадия денатурации. ДНК денатурируется при высокой температуре — обычно 94 °C (201 °F).
- Стадия промежуточного отжига. Установите промежуточную температуру отжига, которая позволяет гибридизировать ДНК аллелей мутанта и дикого типа друг с другом. Поскольку ДНК мутантного аллеля составляет меньшинство ДНК в смеси, они с большей вероятностью образуют несовпадающую гетеродуплексную ДНК с ДНК дикого типа.
- Стадия плавления. Эти гетеродуплексы легче плавятся при более низких температурах. Следовательно, они избирательно денатурируются по Tc.
- Стадия первичного отжига. Гомодуплексная ДНК предпочтительно останется двухцепочечной и не будет доступна для отжига праймера.
- Стадия продления. ДНК-полимераза будет комплементарна матричной ДНК. Поскольку гетеродуплексная ДНК используется в качестве матрицы, большая часть минорных вариантов ДНК будет амплифицирована и доступна для последующих раундов ПЦР.
На сегодняшний день разработаны две формы ХОЛОДНОЙ ПЦР. Полная ХОЛОДНАЯ ПЦР и быстрая ХОЛОДНАЯ ПЦР.
Полный
[ редактировать ]Полная ХОЛОДНАЯ ПЦР идентична протоколу, описанному выше. Эти пять ступеней используются для каждого раунда усиления.
Быстрый
[ редактировать ]Быстрая ХОЛОД-ПЦР отличается от полной ХОЛОД-ПЦР тем, что этапы денатурации и промежуточного отжига пропускаются. Это связано с тем, что в некоторых случаях преимущественная амплификация мутантной ДНК настолько велика, что обеспечение образования гетеродуплексной ДНК мутант/дикий тип не требуется. Таким образом, денатурация может произойти в точке Tc, перейти к отжигу праймера и затем опосредованному полимеразой удлинению. Каждый раунд амплификации будет включать эти три этапа в указанном порядке. При использовании более низкой температуры денатурации реакция будет дискриминировать продукты с более низкой Tm, то есть варианты аллелей. Быстрая ХОЛОД-ПЦР дает гораздо более быстрые результаты благодаря сокращенному протоколу, тогда как полная ХОЛОД-ПЦР необходима для амплификации всех возможных мутаций в исходной смеси ДНК.
Двухраундная ХОЛОД-ПЦР представляет собой модифицированную версию быстрой ХОЛОД-ПЦР. Во втором раунде быстрой COLD-PCR используются вложенные праймеры. Это повышает чувствительность обнаружения мутаций по сравнению с однораундной быстрой ХОЛОДНОЙ ПЦР. [1]
Использование
[ редактировать ]ХОЛОДНАЯ ПЦР использовалась для повышения надежности ряда различных анализов, в которых традиционно используется традиционная ПЦР.
ПДРФ
[ редактировать ]Полиморфизм длины рестрикционного фрагмента приводит к расщеплению (или его отсутствию) ДНК для специфической мутации выбранным ферментом рестрикции, который не расщепляет ДНК дикого типа. В исследовании с использованием смеси ДНК дикого типа и ДНК, содержащей мутации, амплифицированной с помощью обычной ПЦР или ХОЛД-ПЦР, было показано, что ХОЛОД-ПЦР, предшествующая RFLP-анализу, улучшает обнаружение мутаций в 10-20 раз. [2]
Секвенирование по Сэнгеру
[ редактировать ]Недавно секвенирование по Сэнгеру было использовано для оценки обогащения мутантной ДНК смесью 1:20 мутант:ДНК дикого типа. Вариант ДНК, содержащий мутацию, был получен из линии клеток рака молочной железы, о которой известно, что она содержит мутации р53 . [1] Сравнение хроматограмм секвенирования по Сэнгеру показало, что мутантный аллель был обогащен в 13 раз при использовании ХОЛОДНОЙ ПЦР по сравнению с одной только традиционной ПЦР. [1] Это определялось размером пиков на хроматограмме в месте расположения вариантного аллеля.
Кроме того, ХОЛОД-ПЦР использовалась для обнаружения мутаций р53 в образцах аденокарциномы легких . В ходе исследования удалось обнаружить 8 мутаций низкого уровня (с распространенностью менее 20%), которые, вероятно, были бы пропущены с помощью обычных методов, которые не обогащают ДНК вариантными последовательностями.
Пиросеквенирование
[ редактировать ]Было показано, что, как и при прямом секвенировании по Сэнгеру, с помощью пиросеквенирования ХОЛОД-ПЦР способна обнаруживать мутации, распространенность которых составляет 0,5–1% в использованных образцах. [3] ХОЛОДНАЯ ПЦР использовалась для обнаружения мутаций p53 и KRAS с помощью пиросеквенирования, и было показано, что в обоих случаях она превосходит традиционную ПЦР.
МАЛЬДИ-ТОФ
[ редактировать ]Та же исследовательская группа, которая разработала COLD-PCR и использовала ее для сравнения чувствительности обычной ПЦР для генотипирования с прямым секвенированием по Сэнгеру, RFLP и пиросеквенированием, также провела аналогичное исследование с использованием MALDI-TOF в качестве последующего приложения для обнаружения мутаций. Их результаты показали, что ХОЛОД-ПЦР может обогатить мутационные последовательности из смеси ДНК в 10–100 раз и что будут обнаруживаться мутации с начальной распространенностью 0,1–0,5%. [4] По сравнению с уровнем обнаружения низкого уровня 5–10%, ожидаемым при традиционной ПЦР.
КПЦР
[ редактировать ]Было показано, что ХОЛОД-ПЦР, проведенная на аппарате для количественной ПЦР с использованием зондов TaqMan , специфичных для мутации, увеличивает измеренную разницу между образцами мутантов и диких типов. [4]
Преимущества
[ редактировать ]- Одноэтапный метод, способный обогащать как известные, так и неизвестные миноритарные аллели независимо от типа и положения мутации.
- Не требует дополнительных дорогостоящих реагентов или специального оборудования.
- Лучше, чем обычная ПЦР для обнаружения мутаций в смешанном образце.
- Не увеличивает существенно время проведения эксперимента по сравнению с обычной ПЦР.
Недостатки
[ редактировать ]- Оптимальный Tc необходимо измерять и определять для каждого ампликона, что добавляет дополнительный этап к традиционным процедурам, основанным на ПЦР.
- Требование точного контроля температуры денатурации во время ПЦР с точностью ± 0,3 °C (0,54 °F)
- Подходящая критическая температура может отсутствовать, которая позволяет различать мутантные последовательности ДНК и последовательности ДНК дикого типа.
- Ограничено анализом последовательностей размером менее 200 п.н.
- Уязвим к ошибкам, вносимым полимеразой.
- Переменное общее количество мутаций, зависящее от положения ДНК и замены нуклеотидов
- Нет гарантии, что все мутации низкого уровня будут преимущественно обогащены.
История
[ редактировать ]ХОЛОД-ПЦР была первоначально описана Li et al. в статье Nature Medicine, опубликованной в 2008 году лабораторной группой Майка Макригиоргоса в Институте рака Даны Фарбер Гарвардской медицинской школы. [2] Как резюмировалось выше, эта технология использовалась в ряде экспериментов по проверке принципа действия и медицинских исследовательских диагностических экспериментах.
Недавно технология COLD-PCR была лицензирована компанией Transgenomic, Inc. Условия лицензии включают эксклюзивные права на коммерциализацию технологии в сочетании с секвенированием по Сэнгеру. В планах разработка коммерческих приложений, которые позволят быстро и с высокой чувствительностью обнаруживать низкоуровневые соматические и митохондриальные мутации ДНК. [5]
Альтернативы
[ редактировать ]Для обнаружения мутаций ДНК меньшинств доступны и другие технологии, и эти методы можно разделить на их способность обогащать и обнаруживать известные или неизвестные мутации. [6]
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Перейти обратно: а б с Ли Дж., Милбери, Калифорния, Ли С., Макригиоргос, ГМ (ноябрь 2009 г.). «Двухраундовое секвенирование по Сэнгеру на основе ХОЛОДНОЙ ПЦР идентифицирует новый спектр мутаций низкого уровня при аденокарциноме легких» . Человеческая мутация . 30 (11): 1583–90. дои : 10.1002/humu.21112 . ПМК 2784016 . ПМИД 19760750 .
- ^ Перейти обратно: а б Ли Дж., Ван Л., Мамон Х., Кулке М.Х. , Бербеко Р., Макригиоргос Г.М. (май 2008 г.). «Замена ПЦР на ХОЛОДНУЮ ПЦР обогащает варианты последовательностей ДНК и переопределяет чувствительность генетического тестирования». Природная медицина . 14 (5): 579–84. дои : 10.1038/nm1708 . ПМИД 18408729 . S2CID 205385306 .
- ^ Цзо З., Чен С.С., Чандра П.К. и др. (август 2009 г.). «Применение COLD-PCR для улучшения обнаружения мутаций KRAS в клинических образцах» . Современная патология . 22 (8): 1023–31. дои : 10.1038/modpathol.2009.59 . ПМИД 19430420 .
- ^ Перейти обратно: а б Ли Дж., Генеральный директор Макригиоргоса (апрель 2009 г.). «ХОЛОДНАЯ ПЦР: новая платформа для улучшенного обнаружения мутаций при раке и генетическом тестировании». Труды Биохимического общества . 37 (2): 427–32. дои : 10.1042/BST0370427 . ПМИД 19290875 .
- ^ Редакция Laboratorytalk (октябрь 2009 г.). «Трансгеномика лицензирует технологию ХОЛОДНОЙ ПЦР» . Архивировано из оригинала 18 июля 2011 г. Проверено 4 марта 2010 г.
- ^ Милбери, Калифорния, Ли Дж., Макригиоргос, генеральный директор (апрель 2009 г.). «Методы обогащения миноритарных аллелей и мутаций на основе ПЦР» . Клиническая химия . 55 (4): 632–40. дои : 10.1373/clinchem.2008.113035 . ПМЦ 2811432 . ПМИД 19201784 .