Мультиплексная амплификация зонда, зависимая от лигирования

Мультиплексная амплификация зонда, зависимая от лигирования ( MLPA ), представляет собой разновидность мультиплексной полимеразной цепной реакции , которая позволяет амплифицировать несколько мишеней только с одной парой праймеров . ^[1] Он обнаруживает изменения количества копий на молекулярном уровне, а для анализа используются программы. Идентификация делеций или дупликаций может указывать на патогенные мутации, поэтому MLPA является важным диагностическим инструментом, используемым в лабораториях клинической патологии по всему миру.

История

Мультиплексная амплификация зонда, зависимая от лигирования, была изобретена Яном Схоутеном , голландским ученым. ^[1] Впервые метод был описан в 2002 году в научном журнале Nucleic Acid Research . ^[2] Первые применения включали обнаружение делеций экзонов в человеческих генах BRCA1 , MSH2 и MLH1 , которые связаны с наследственным раком молочной железы и толстой кишки. Сейчас MLPA используется для выявления сотен наследственных заболеваний, а также для профилирования опухолей.

Описание

MLPA количественно определяет наличие определенных последовательностей в образце ДНК, используя специально разработанную пару зондов для каждой интересующей целевой последовательности. Процесс состоит из нескольких этапов: ^[3]

ДНК образца денатурируется , в результате чего образуется одноцепочечная ДНК образца.
Пары зондов гибридизуются с образцом ДНК, причем каждая пара зондов предназначена для запроса наличия определенной последовательности ДНК.
Лигаза применяется к гибридизованной ДНК, объединяя пары зондов, которые гибридизуются непосредственно рядом друг с другом, в одну цепь ДНК, которую можно амплифицировать с помощью ПЦР.
ПЦР амплифицирует все пары зондов, которые были успешно лигированы, с использованием флуоресцентно меченных праймеров для ПЦР.
Продукты ПЦР количественно определяют, как правило, с помощью (капиллярного) электрофореза .

Каждая пара зондов состоит из двух олигонуклеотидов с последовательностью, которая распознает соседние участки целевой ДНК , сайта праймирования ПЦР и, необязательно, «наполнителя», придающего продукту ПЦР уникальную длину по сравнению с другими парами зондов в анализе MLPA. Каждая полная пара зондов должна иметь уникальную длину, чтобы полученные ампликоны можно было однозначно идентифицировать во время количественного определения, избегая ограничений разрешения мультиплексной ПЦР . Поскольку прямой праймер, используемый для амплификации зонда, флуоресцентно помечен, каждый ампликон генерирует флуоресцентный пик, который можно обнаружить с помощью капиллярного секвенатора. Сравнивая структуру пиков, полученную на данном образце, с картиной пиков, полученной на различных эталонных образцах, можно определить относительное количество каждого ампликона. Это соотношение является мерой соотношения, в котором целевая последовательность присутствует в образце ДНК.

Различные методы, включая DGGE ( денатурирующий градиентный гель-электрофорез ), DHPLC ( денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография ) и SSCA (анализ одноцепочечной конформации), эффективно идентифицируют SNP, а также небольшие вставки и делеции. Однако MLPA является одним из единственных точных и эффективных по времени методов обнаружения геномных делеций и вставок (одного или нескольких полных экзонов), которые часто являются причинами таких видов рака, как наследственный неполипозный колоректальный рак ( HNPCC ), рак молочной железы и рак прямой кишки. рак яичников. MLPA может успешно и легко определять относительное количество копий всех экзонов внутри гена одновременно с высокой чувствительностью.

Относительная плоидность

Важным применением MLPA является определение относительной плоидности . Например, можно сконструировать зонды, нацеленные на различные области хромосомы 21 клетки человека. Силы сигналов зондов сравниваются с сигналами, полученными от эталонного образца ДНК, который, как известно, содержит две копии хромосомы. Если в тестовом образце присутствует дополнительная копия, ожидается, что сигналы будут в 1,5 раза превышать интенсивность соответствующих датчиков от эталона. Если присутствует только одна копия, ожидается, что доля составит 0,5. Если в образце две копии, ожидается, что относительная сила зонда будет одинаковой.

Анализ коэффициента дозировки

Анализ коэффициента дозировки является обычным методом интерпретации данных MLPA. ^[4] Если a и b являются сигналами от двух ампликонов в образце пациента, а A и B являются соответствующими ампликонами в экспериментальном контроле, то коэффициент дозировки DQ = (a/b)/(A/B). Хотя коэффициенты дозировки можно рассчитать для любой пары ампликонов, обычно один из пар является внутренним эталонным зондом.

Приложения

MLPA облегчает амплификацию и обнаружение нескольких мишеней с помощью одной пары праймеров. В стандартной реакции мультиплексной ПЦР каждому фрагменту требуется уникальная пара амплифицированных праймеров. Наличие этих праймеров в большом количестве приводит к различным проблемам, таким как димеризация и ложное праймирование. С помощью MLPA можно добиться амплификации зондов. Таким образом, многие последовательности (до 40) можно амплифицировать и количественно оценить, используя всего лишь одну пару праймеров. Реакция MLPA быстрая, недорогая и очень простая в исполнении.

MLPA имеет множество применений ^[5] включая обнаружение мутаций и однонуклеотидных полиморфизмов , ^[6] ДНК анализ метилирования , ^[7] относительное количественное определение мРНК , ^[8] хромосомная характеристика клеточных линий и образцов тканей, ^[9] определение количества копий гена, ^[10] обнаружение дупликаций и делеций в генах предрасположенности к раку человека , таких как BRCA1 , BRCA2 , hMLH1 и hMSH2 ^[11] и анеуплоидии . определение ^[12] MLPA потенциально может применяться в пренатальной диагностике, как инвазивной, так и ^[13] и неинвазивный . ^[14]

Недавние исследования показали, что MLPA (а также другие варианты, такие как iMLPA) является надежным методом инверсионной характеристики. ^[15]

Варианты

iMLPA

Гинер-Дельгадо, Карла и др. описал вариант MLPA, сочетающий его с иПЦР. Они называют этот новый метод iMLPA. ^[15] и его процедура такая же, как и MLPA, но в начале необходимы два дополнительных шага:

Во-первых, необходима обработка ДНК рестриктазами, которые разрезают обе стороны интересующей области.
Фрагменты, полученные в результате пищеварения, рециркулируются и связываются.

Конструкция зонда очень похожа. Каждый зонд будет состоять из двух частей, которые имеют как минимум: целевую последовательность , которая представляет собой область, содержащую последовательность, комплементарную интересующей области, чтобы могла произойти правильная гибридизация. И последовательность праймеров в конце — это последовательность, конструкция которой варьируется и которая позволит создавать праймеры и последующую амплификацию фрагментов. Кроме того, одна из частей зонда обычно содержит наполнитель между целевой последовательностью и последовательностью праймера. Использование разных наполнителей позволяет идентифицировать зонды с одинаковыми последовательностями праймеров, но разными целевыми последовательностями, что является ключевым моментом для множественной амплификации нескольких разных фрагментов в одной реакции.

Следующий шаг продолжается с использованием типичного протокола MLPA. ^[1]

Ссылки

^ Jump up to: ^а ^б ^с Схоутен Дж.П., МакЭлгунн С.Дж., Ваайер Р., Звейненбург Д., Диепвенс Ф., Палс Г. (2002). «Относительная количественная оценка 40 последовательностей нуклеиновых кислот путем мультиплексной амплификации зонда, зависящей от лигирования» . Нуклеиновые кислоты Рез . 30 (12): 57д–57. дои : 10.1093/нар/gnf056 . ПМЦ 117299 . ПМИД 12060695 .
^ Схоутен Дж.П., МакЭлганн С.Дж., Вайер Р., Звейненбург Д., Дипвенс Ф., Палс Г. (15 июня 2002 г.). «Относительная количественная оценка 40 последовательностей нуклеиновых кислот путем мультиплексной амплификации зонда, зависящей от лигирования» . Исследования нуклеиновых кислот . 30 (12): е57. дои : 10.1093/нар/gnf056 . ISSN 0305-1048 . ПМЦ 117299 . ПМИД 12060695 .
^ «Мультиплексная амплификация зонда, зависимая от лигирования (MLPA)» . Биоразмер укуса . 27 декабря 2018 г. Проверено 7 июня 2021 г.
^ Яу С.К., Бобров М., Мэтью К.Г., Эббс С.Дж. (1996). «Точная диагностика носителей делеций и дупликаций при мышечной дистрофии Дюшенна/Беккера методом флуоресцентного дозового анализа» . Дж. Мед. Жене . 33 (7): 550–558. дои : 10.1136/jmg.33.7.550 . ПМЦ 1050661 . ПМИД 8818939 .
^ Список статей, связанных с MLPA. Архивировано 20 февраля 2007 г. на Wayback Machine.
^ Воликос Э., Робинсон Дж., Айттомаки К., Меклин Дж.П., Ярвинен Х., Вестерман А.М., де Руджи Ф.В., Фогель Т., Мослейн Г., Лаунонен В., Томлинсон И.П., Сильвер А.Р., Аалтонен Л.А. (2006). «Удаления экзонов и целых генов LKB1 являются частой причиной синдрома Пейтца-Егерса» . Дж. Мед. Жене . 43 (5): е18. дои : 10.1136/jmg.2005.039875 . ПМК 2564523 . ПМИД 16648371 .
^ Проктер М., Чжоу Л.С., Тан В., Джама М., Мао Р. (2006). «Молекулярная диагностика синдромов Прадера-Вилли и Ангельмана с помощью анализа плавления, специфичного для метилирования, и специфичной для метилирования мультиплексной амплификации зонда, зависимой от лигирования» (PDF) . Клин. Хим . 52 (7): 1276–1283. дои : 10.1373/clinchem.2006.067603 . ПМИД 16690734 .
^ Венер М., Мангольд Э., Сенгтеллер М., Фридрихс Н., Арец С., Фридл В., Проппинг П., Пагенштехер С. (2005). «Наследственный неполипозный колоректальный рак: ошибки при скрининге делеций в генах MSH2 и MLH1» . Евро. Дж. Хум. Жене . 13 (8): 983–986. дои : 10.1038/sj.ejhg.5201421 . ПМИД 15870828 .
^ Уилтинг С.М., Снейдерс П.Дж., Мейер Г.А., Илстра Б., Ван ден Эйссел П.Р., Снейдерс А.М., Альбертсон Д.Г., Коффа Дж., Схоутен Дж.П., ван де Виль М.А., Мейер С.Дж., Стинберген Р.Д. (2006). «Увеличенное количество копий гена в хромосоме 20q часто встречается как при плоскоклеточном раке, так и при аденокарциноме шейки матки». Дж. Патол . 209 (2): 220–230. дои : 10.1002/путь.1966 . ПМИД 16538612 . S2CID 25427077 .
^ Введение в MLPA
^ Буньян DJ, Эклс Д.М., Силлиборн Дж., Уилкинс Э., Томас Н.С., Ши-Саймондс Дж., Дункан П.Дж., Кертис CE, Робинсон Д.О., Харви Дж.Ф., Кросс NC (2004). «Анализ дозировки генов предрасположенности к раку путем мультиплексной амплификации зонда, зависимой от лигирования» . Бр. Дж. Рак . 91 (6): 1155–1159. дои : 10.1038/sj.bjc.6602121 . ПМЦ 2747696 . ПМИД 15475941 .
^ Гердес Т., Кирхгоф М., Линд А.М., Ларсен Г.В., Шварц М., Лундстин С. (2005). «Компьютерный пренатальный скрининг анеуплоидии хромосом 13, 18, 21, X и Y на основе мультиплексной амплификации зонда, зависимой от лигирования (MLPA)» . Евро. Дж. Хум. Жене . 13 (2): 171–175. дои : 10.1038/sj.ejhg.5201307 . ПМИД 15483643 .
^ Хохстенбах Р., Мейер Дж., ван де Бруг Дж., Воссебельд-Хофф И., Янсен Р., ван дер Люйт Р.Б., Синке Р.Дж., Пейдж-Кристианс Г.К., Плоос ван Амстел Дж.К., де Патер Дж.М. (2005). «Быстрое обнаружение хромосомных анеуплоидий в некультивируемых амниоцитах с помощью мультиплексной амплификации зонда, зависимой от лигирования (MLPA)». Пренат. Диагностика . 25 (11): 1032–1039. дои : 10.1002/pd.1247 . ПМИД 16231311 . S2CID 23214645 .
^ Илланес С., Авент Н., Сутхилл П.В. (2005). «Бесклеточная ДНК плода в плазме матери: важный шаг в связи генетики плода с акушерским ультразвуком» . Ультразвуковой акушер. Гинекол . 25 (4): 317–322. дои : 10.1002/уог.1881 . ПМИД 15789415 .
^ Jump up to: ^а ^б Гинер-Дельгадо, К., Вильяторо, С., Лерга-Хасо, Дж., Гая-Видаль, М., Олива, М., Кастеллано, Д., ... и Олальде, И. (2019). Эволюционное и функциональное влияние распространенных полиморфных инверсий в геноме человека. Природные коммуникации , 10 (1), 1-14. https://doi.org/10.1038/s41467-019-12173-x

Внешние ссылки

Дальнейшие применения MLPA

[:0-1] Jump up to: ^а ^б ^с Схоутен Дж.П., МакЭлгунн С.Дж., Ваайер Р., Звейненбург Д., Диепвенс Ф., Палс Г. (2002). «Относительная количественная оценка 40 последовательностей нуклеиновых кислот путем мультиплексной амплификации зонда, зависящей от лигирования» . Нуклеиновые кислоты Рез . 30 (12): 57д–57. дои : 10.1093/нар/gnf056 . ПМЦ 117299 . ПМИД 12060695 .

[2] Схоутен Дж.П., МакЭлганн С.Дж., Вайер Р., Звейненбург Д., Дипвенс Ф., Палс Г. (15 июня 2002 г.). «Относительная количественная оценка 40 последовательностей нуклеиновых кислот путем мультиплексной амплификации зонда, зависящей от лигирования» . Исследования нуклеиновых кислот . 30 (12): е57. дои : 10.1093/нар/gnf056 . ISSN 0305-1048 . ПМЦ 117299 . ПМИД 12060695 .

[3] «Мультиплексная амплификация зонда, зависимая от лигирования (MLPA)» . Биоразмер укуса . 27 декабря 2018 г. Проверено 7 июня 2021 г.

[4] Яу С.К., Бобров М., Мэтью К.Г., Эббс С.Дж. (1996). «Точная диагностика носителей делеций и дупликаций при мышечной дистрофии Дюшенна/Беккера методом флуоресцентного дозового анализа» . Дж. Мед. Жене . 33 (7): 550–558. дои : 10.1136/jmg.33.7.550 . ПМЦ 1050661 . ПМИД 8818939 .

[5] Список статей, связанных с MLPA. Архивировано 20 февраля 2007 г. на Wayback Machine.

[6] Воликос Э., Робинсон Дж., Айттомаки К., Меклин Дж.П., Ярвинен Х., Вестерман А.М., де Руджи Ф.В., Фогель Т., Мослейн Г., Лаунонен В., Томлинсон И.П., Сильвер А.Р., Аалтонен Л.А. (2006). «Удаления экзонов и целых генов LKB1 являются частой причиной синдрома Пейтца-Егерса» . Дж. Мед. Жене . 43 (5): е18. дои : 10.1136/jmg.2005.039875 . ПМК 2564523 . ПМИД 16648371 .

[7] Проктер М., Чжоу Л.С., Тан В., Джама М., Мао Р. (2006). «Молекулярная диагностика синдромов Прадера-Вилли и Ангельмана с помощью анализа плавления, специфичного для метилирования, и специфичной для метилирования мультиплексной амплификации зонда, зависимой от лигирования» (PDF) . Клин. Хим . 52 (7): 1276–1283. дои : 10.1373/clinchem.2006.067603 . ПМИД 16690734 .

[8] Венер М., Мангольд Э., Сенгтеллер М., Фридрихс Н., Арец С., Фридл В., Проппинг П., Пагенштехер С. (2005). «Наследственный неполипозный колоректальный рак: ошибки при скрининге делеций в генах MSH2 и MLH1» . Евро. Дж. Хум. Жене . 13 (8): 983–986. дои : 10.1038/sj.ejhg.5201421 . ПМИД 15870828 .

[9] Уилтинг С.М., Снейдерс П.Дж., Мейер Г.А., Илстра Б., Ван ден Эйссел П.Р., Снейдерс А.М., Альбертсон Д.Г., Коффа Дж., Схоутен Дж.П., ван де Виль М.А., Мейер С.Дж., Стинберген Р.Д. (2006). «Увеличенное количество копий гена в хромосоме 20q часто встречается как при плоскоклеточном раке, так и при аденокарциноме шейки матки». Дж. Патол . 209 (2): 220–230. дои : 10.1002/путь.1966 . ПМИД 16538612 . S2CID 25427077 .

[10] Введение в MLPA

[11] Буньян DJ, Эклс Д.М., Силлиборн Дж., Уилкинс Э., Томас Н.С., Ши-Саймондс Дж., Дункан П.Дж., Кертис CE, Робинсон Д.О., Харви Дж.Ф., Кросс NC (2004). «Анализ дозировки генов предрасположенности к раку путем мультиплексной амплификации зонда, зависимой от лигирования» . Бр. Дж. Рак . 91 (6): 1155–1159. дои : 10.1038/sj.bjc.6602121 . ПМЦ 2747696 . ПМИД 15475941 .

[12] Гердес Т., Кирхгоф М., Линд А.М., Ларсен Г.В., Шварц М., Лундстин С. (2005). «Компьютерный пренатальный скрининг анеуплоидии хромосом 13, 18, 21, X и Y на основе мультиплексной амплификации зонда, зависимой от лигирования (MLPA)» . Евро. Дж. Хум. Жене . 13 (2): 171–175. дои : 10.1038/sj.ejhg.5201307 . ПМИД 15483643 .

[13] Хохстенбах Р., Мейер Дж., ван де Бруг Дж., Воссебельд-Хофф И., Янсен Р., ван дер Люйт Р.Б., Синке Р.Дж., Пейдж-Кристианс Г.К., Плоос ван Амстел Дж.К., де Патер Дж.М. (2005). «Быстрое обнаружение хромосомных анеуплоидий в некультивируемых амниоцитах с помощью мультиплексной амплификации зонда, зависимой от лигирования (MLPA)». Пренат. Диагностика . 25 (11): 1032–1039. дои : 10.1002/pd.1247 . ПМИД 16231311 . S2CID 23214645 .

[14] Илланес С., Авент Н., Сутхилл П.В. (2005). «Бесклеточная ДНК плода в плазме матери: важный шаг в связи генетики плода с акушерским ультразвуком» . Ультразвуковой акушер. Гинекол . 25 (4): 317–322. дои : 10.1002/уог.1881 . ПМИД 15789415 .

[:1-15] Jump up to: ^а ^б Гинер-Дельгадо, К., Вильяторо, С., Лерга-Хасо, Дж., Гая-Видаль, М., Олива, М., Кастеллано, Д., ... и Олальде, И. (2019). Эволюционное и функциональное влияние распространенных полиморфных инверсий в геноме человека. Природные коммуникации , 10 (1), 1-14. https://doi.org/10.1038/s41467-019-12173-x

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]

[13]

[14]

[15]

v т и полимеразной цепной реакции Методы
Процедура	Инициализация Цикл Денатурация Отжиг Удлинение Окончательное удлинение Окончательное удержание
Полимераза	Кленов Т4 и Т7 Так Тт Пфу Вентиляция Проф. Тли Уф
Оптимизация и варианты	Количественная полимеразная цепная реакция (кПЦР) Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) Обратная полимеразная цепная реакция (обратная ПЦР) Вложенная полимеразная цепная реакция (вложенная ПЦР) Полимеразная цепная реакция приземления ПЦР с горячим стартом Полимеразная цепная реакция с перекрытием (OE-PCR) Мультиплексная полимеразная цепная реакция (мультиплексная ПЦР) Мультиплексная амплификация зонда, зависимая от лигирования (MLPA) Коамплификация при более низкой температуре денатурации ПЦР (ХОЛОДНАЯ ПЦР) Случайная амплификация полиморфной ДНК (RAPD)
История и люди	Кэри Маллис Кьелл Клеппе Алиса Дог