Гель температуры электрофорез
Электрофорез геля температурного градиента ( TGGE ) и денатурирующий гель -гель -электрофорез ( DGGE ) представляют собой формы электрофореза , которые используют либо температуру, либо химический градиент для денатуры образца, когда он перемещается через акриламидный гель. TGGE и DGGE могут применяться к нуклеиновым кислотам, таким как ДНК и РНК , и (менее часто) белки. TGGE зависит от изменений в зависимости от температуры в структуре для отдельных нуклеиновых кислот . DGGE отделяет гены того же размера на основе их различной денатурирующей способности, которая определяется по последовательности пары оснований. DGGE был оригинальной техникой, и это уточняет ее.
История
[ редактировать ]DGGE был изобретен Леонардом Лерманом , в то время как он был профессором в Suny Albany. [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]
То же самое оборудование можно использовать для анализа белка , который был впервые выполнен Томасом Э. Крейтоном из лаборатории MRC молекулярной биологии , Кембридж, Англия. [ 4 ] Аналогичные виды образовались белками и нуклеиновыми кислотами, но фундаментальные принципы совершенно разные.
TGGE был впервые описан Тэтчером и Ходсоном [ 5 ] и Роджер Вартелл из Georgia Tech. Обширная работа была проделана группа Риснера в Германии. Коммерческое оборудование для DGGE доступно от Bio-Rad, Ingeny и CBS Scientific; Система для TGGE доступна в биометре.
Гель температуры электрофорез
[ редактировать ]ДНК имеет отрицательный заряд, и поэтому будет перемещаться к положительному электроду в электрическом поле. Гель представляет собой молекулярную сетку, с отверстиями примерно такого же размера, как диаметр струны ДНК. Когда применяется электрическое поле, ДНК начнет двигаться через гель, на скорости, примерно обратно пропорциональной длине молекулы ДНК (более короткая длина движения ДНК быстрее) - это основа для зависимого от размера разделения при стандартном электрофорезе Полем
В TGGE также существует градиент температуры по всему гелу. При комнатной температуре ДНК будет существовать в двухцепочечной форме. По мере повышения температуры пряди начинают отделяться ( плавление ), а скорость, с которой они движутся через гель, резко уменьшается. Критически, температура, при которой происходит плавление, зависит от последовательности (GC -басы более стабильны, чем при взаимодействии с укладками, а не из -за разницы в водородных связях. [ Цитация необходима ] (Существует три водородные связи между парой цитозина и гуанина основания , но только две между аденином и тимином )), поэтому TGGE обеспечивает «зависимый от последовательности, независимый от размера метод» для разделения молекул ДНК. TGGE отделяет молекулы и дает дополнительную информацию о поведении и стабильности плавления (Biometra, 2000).
Денатурирующий градиент гель электрофорез
[ редактировать ]Денатурирующий градиент гель электрофорез (DGGE) работает, применяя небольшой образец ДНК (или РНК) к гелю электрофореза, который содержит денатурирующий агент. Исследователи обнаружили, что определенные денатурирующие гели способны выводить ДНК раста на разных этапах. В результате этого таяния ДНК распространяется через гель и может быть проанализирована на для отдельных компонентов, даже в размере 200-700 пар оснований .
Что уникально в технике DGGE, так это то, что по мере того, как ДНК подвергается все более экстремальным денатурирующим условиям, расплавленные пряди полностью фрагмент в отдельные пряди. Процесс денатурации на денатурирующем геле очень острый: «вместо частично плавления непрерывной молнии, большинство фрагментов таят в пошаговом процессе. Дискретные части или области фрагмента внезапно становятся одноцепочечными в пределах очень Узкий диапазон денатурирующих условий »(Helms, 1990). Это позволяет различить различия в последовательностях ДНК или мутациях различных генов: различия последовательностей в фрагментах одинаковой длины часто заставляют их частично таять в разных положениях в градиенте и, следовательно, «останавливаться» в разных положениях в геле. Сравнивая поведение плавления полиморфных фрагментов ДНК рядом с денатурирующими градиентными гелями, можно обнаружить фрагменты, которые имеют мутации в первом домене плавления (Helms, 1990). Размещение двух образцов рядом на геле и позволяя им Деналюция вместе, исследователи могут легко увидеть даже самые маленькие различия в двух образцах или фрагментах ДНК.
В этом методе есть ряд недостатков: «Химические градиенты, такие как те, которые используются в DGGE, не так воспроизводимы, трудно установить и часто не полностью разрешают гетеродуплексы » (Westburg, 2001). Эти проблемы решаются с помощью TGGE, который использует температуру, а не химический градиент для денатуру образца.
Метод
[ редактировать ]Чтобы разделить нуклеиновые кислоты с помощью TGGE, необходимо выполнить следующие шаги: приготовление и наличие гелей, электрофорез, окрашивания и элюирования ДНК. Поскольку необходимо выбрать буферизованная система, важно, чтобы система оставалась стабильной в контексте повышения температуры. Таким образом, мочевина обычно используется для подготовки геля; Тем не менее, исследователи должны знать, что количество используемой мочевины будет влиять на общую температуру, необходимую для разделения ДНК. [ 6 ] Гель загружается, образец помещается на гель в соответствии с типом геля, который запускается - параллельно или перпендикулярно - напряжение регулируется, и образец можно запустить. [ 6 ] В зависимости от того, какой тип TGGE должен выполняться, либо перпендикулярно , либо параллельно , необходимо подготовить и загружать различные количества образца. Большее количество одного образца используется с перпендикулярной, в то время как с параллельным TGGE используется меньшее количество многих образцов. Как только гель будет запущен, гель должен быть окрашен, чтобы визуализировать результаты. Несмотря на то, что для этой цели можно использовать ряд пятен, окрашивание серебра оказалось наиболее эффективным инструментом. [ 6 ] ДНК может быть элюирована из пятна серебра для дальнейшего анализа с помощью ПЦР -усиления. [ 6 ]
Приложения
[ редактировать ]TGGE и DGGE в целом полезны в биомедицинских и экологических исследованиях; Выбранные приложения описаны ниже.
Мутации в мтДНК
[ редактировать ]Согласно недавнему расследованию Wong, Liang, Kwon, Bai, Alper и Gropman, [ 7 ] TGGE можно использовать для изучения митохондриальной ДНК человека. По словам этих авторов, TGGE был использован для определения двух новых мутаций в митохондриальном геноме : «21-летняя женщина, которая была подозревана в митохондриальной цитопатии, но была отрицательной для общей митохондриальной ДНК (мтДНК) точечных мутаций и делеций, была отрицательной для общей митохондриальной ДНК (мтДНК). Для неизвестных мутаций во всем митохондриальном геноме путем электрофореза в градиенте температуры. [ 8 ]
Мутация p53 в выделениях поджелудочной железы
[ редактировать ]Lohr and Coworkers (2001) отчет [ Цитация необходима ] Это в комплексном исследовании секреции поджелудочной железы людей без рака поджелудочной железы , мутации p53 могут быть обнаружены в соках поджелудочной железы небольшого процента участников. Поскольку мутации p53 были широко обнаружены в карциномах поджелудочной железы, исследователи для этого исследования пытались определить, может ли сама мутация быть связана с развитием рака поджелудочной железы. В то время как Lohr смог найти мутации p53 через TGGE у нескольких субъектов, ни у одного впоследствии не разработал рак поджелудочной железы. Таким образом, исследователи заключают, отметив, что мутация р53 может не быть единственным показателем онкогенеза карциномы поджелудочной железы.
Микробная экология
[ редактировать ]DGGE малых рибосомных субъединичных генов был впервые описан Джерардом Муйзером , [ 9 ] В то время как он был постдоком в Университете Лейден и стал широко используемой техникой в микробной экологии.
ПЦР -амплификация ДНК, экстрагированной из смешанных микробных сообществ с ПЦР -праймерами, специфичными для фрагментов гена 16S рРНК бактерий и археи , и фрагменты гена 18S рРНК эукариот приводят к смесям продуктов ПЦР. Поскольку все эти ампликоны имеют одинаковую длину, они не могут быть отделены друг от друга электрофорезом агарозного геля. Однако изменения последовательности (т.е. различия в содержании и распределении GC) между различными микробными RRNAS приводят к различным свойствам денатурации этих молекул ДНК.
Следовательно, паттерны полос DGGE могут использоваться для визуализации вариаций в микробном генетическом разнообразии и обеспечения приблизительной оценки богатства изобилия преобладающих членов микробного сообщества. Этот метод часто называют отпечатком пальцев сообщества . Недавно несколько исследований показали, что DGGE функциональных генов (например, гены, участвующие в восстановлении серы, фиксации азота и окислением аммония) могут одновременно предоставлять информацию о микробной функции и филогении. Например, Tabatabaei et al. (2009) применили DGGE и удалось выявить микробную картину во время анаэробной ферментации сточных вод пальмового масла (POME). [ 10 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Ячейка. 1979 январь; 16 (1): 191-200. Независимое от длины разделение фрагментов рестрикции ДНК в двухмерном гелевом электрофорезе. Фишер С.Г., Лерман Л.С.
- ^ Фишер С.Г. и Лерман Л.С. «Разделение случайных фрагментов ДНК в соответствии со свойствами их последовательностей» Proc. Нат. Академический Наука США, 1980, 77, 4420-4424.
- ^ Fischer SG и Lerman LS «Фрагменты ДНК, различающиеся в результате замены с одной базой-парой, разделены в денатурирующих градиентных гелях: соответствие теорией плавления» Proc. Нат. Академический Наука США, 1983, 80, 1579-1583.
- ^ J Mol Biol. 1994 октябрь 7; 242 (5): 670-82. Электрофоретическая характеристика денатурированных состояний стафилококковой нуклеазы. Creighton TE, Shortle D.
- ^ Биохим. J. (1981) 197, 105-109
- ^ Jump up to: а беременный в дюймовый (Biometra, 2000). [ Цитация необходима ]
- ^ L -jc wong, d yim, r -k bai, h kwon, mm vacek, j zane, cl hoppel e ds kerr. Новая мутация в гене митохондриального трназера (Agy), связанной с митохондриальной миопатией, энцефалопатией и дефицитом комплекса. J Med Genet. Stembro de 2006; 43 (9): E46. doi: 10.1136/jmg.2005.040626. PMCID: PMC2564579. PMID 16950817.
- ^ (Wong et al., 2002). [ Цитация необходима ]
- ^ Muyzer G, de Waal EC, Uitterlinden Ag. (1993) Профилирование сложных микробных популяций путем денатурирующего градиентного гель-анализа электрофореза генов полимеразной цепной реакции, кодирующих 16S рРНК. Appl Environ Microbiol. 59: 695-700.
- ^ Анализ DGGE на основе ПЦР и рыбы метаногенов в ааээробском закрытом расцветании, обработанном лечением стоков мельницы пальмового масла. Meisam Tabatabaei, Mohd Rafein Zakaria, Raha Abdul Rahim, André-Denis G. Wright, Yoshihito Shirai, Norhani Abdullah, Kenji Sakai, Shinya Ikeno, Masatsugu Mori, Nakamura Kazunori, Alawi Sulaiman и Mohdi Hasnan, 2009, 2009, 2009, 2009, 2009, 2009-й, 2009-hassan, 2009. Том 12 № 3, выпуск 15 июля 2009 г., ISSN 0717-3458
- Чарльз Дж. Сэйли, MD, MS Parts, взятые из сводного документа под названием «TGGE». 2003. Университет наук в Филадельфии.
| Базы данных управления авторитетом : национальный |
|---|
