Гель-электрофорез в градиенте температуры
Гель-электрофорез в градиенте температуры ( TGGE ) и электрофорез в денатурирующем градиенте геля ( DGGE ) представляют собой формы электрофореза , в которых используется либо температурный, либо химический градиент для денатурации образца при его движении через акриламидный гель. TGGE и DGGE можно применять к нуклеиновым кислотам, таким как ДНК и РНК , и (реже) к белкам. TGGE основан на температурно-зависимых изменениях структуры для разделения нуклеиновых кислот . DGGE разделяет гены одинакового размера на основе их различной денатурирующей способности, которая определяется последовательностью их пар оснований. DGGE был оригинальной техникой, а TGGE — ее усовершенствованием.
История
[ редактировать ]DGGE был изобретен Леонардом Лерманом , когда он был профессором SUNY в Олбани. [1] [2] [3]
То же самое оборудование можно использовать для анализа белка , что впервые сделал Томас Э. Крейтон из Лаборатории молекулярной биологии MRC , Кембридж, Англия. [4] Белки и нуклеиновые кислоты создают схожие модели, но фундаментальные принципы совершенно разные.
TGGE был впервые описан Тэтчер и Ходсоном. [5] и Роджер Уортелл из Технологического института Джорджии. Обширную работу провела группа Риснера в Германии. Коммерческое оборудование для DGGE можно приобрести у Bio-Rad, INGENY и CBS Scientific; система для TGGE доступна от Biometra.
Гель-электрофорез в градиенте температуры
[ редактировать ]ДНК имеет отрицательный заряд и поэтому в электрическом поле будет двигаться к положительному электроду. Гель представляет собой молекулярную сетку с отверстиями примерно такого же размера, как диаметр нити ДНК. При приложении электрического поля ДНК начнет двигаться через гель со скоростью, примерно обратно пропорциональной длине молекулы ДНК (более короткие участки ДНК перемещаются быстрее) — это основа разделения по размеру в стандартном электрофорезе. .
В TGGE также существует температурный градиент по всему гелю. При комнатной температуре ДНК будет стабильно существовать в двухцепочечной форме. При повышении температуры пряди начинают разделяться ( плавиться ), а скорость их движения через гель резко снижается. Крайне важно, что температура, при которой происходит плавление, зависит от последовательности (пары оснований GC более стабильны, чем AT, из-за стэкинг-взаимодействий, а не из-за разницы в водородных связях. [ нужна ссылка ] есть три водородные связи (между парой оснований цитозина и гуанина , а между аденином и тимином только две )), поэтому TGGE обеспечивает «зависимый от последовательности и независимый от размера метод» разделения молекул ДНК. TGGE разделяет молекулы и дает дополнительную информацию о поведении и стабильности плавления (Biometra, 2000).
Денатурирующий градиентный гель-электрофорез
[ редактировать ]Электрофорез в денатурирующем градиентном геле (DGGE) заключается в нанесении небольшого образца ДНК (или РНК) на гель для электрофореза, содержащий денатурирующий агент. Исследователи обнаружили, что некоторые денатурирующие гели способны вызывать плавление ДНК на различных стадиях. В результате этого плавления ДНК распространяется по гелю и может быть проанализирована на наличие отдельных компонентов, даже таких небольших, как 200-700 пар оснований .
Уникальность метода DGGE заключается в том, что по мере того, как ДНК подвергается все более экстремальным денатурирующим условиям, расплавленные нити полностью фрагментируются на отдельные нити. Процесс денатурации денатурирующего геля очень острый: «Вместо того, чтобы частично плавиться непрерывным образом, подобно застежке-молнии, большинство фрагментов плавятся поэтапно. Отдельные части или домены фрагмента внезапно становятся одноцепочечными в очень узкий диапазон денатурирующих условий» (Helms, 1990). Это позволяет различить различия в последовательностях ДНК или мутации различных генов: различия в последовательностях фрагментов одинаковой длины часто приводят к их частичному плавлению в разных положениях градиента и, следовательно, «остановке» в разных положениях геля. Сравнивая поведение плавления полиморфных фрагментов ДНК рядом с денатурирующими градиентными гелями, можно обнаружить фрагменты, имеющие мутации в первом домене плавления (Helms, 1990). Размещение двух образцов рядом на геле и предоставление им возможности денатурируя вместе, исследователи могут легко увидеть даже самые незначительные различия в двух образцах или фрагментах ДНК.
У этого метода есть ряд недостатков: «Химические градиенты, подобные тем, которые используются в DGGE, не так воспроизводимы, их трудно установить и часто не полностью разрешают гетеродуплексы » (Westburg, 2001). Эти проблемы решаются с помощью TGGE, который для денатурации образца использует температурный, а не химический градиент.
Метод
[ редактировать ]Для разделения нуклеиновых кислот методом ТГГЭ необходимо выполнить следующие этапы: приготовление и заливку гелей, электрофорез, окрашивание и элюирование ДНК. Поскольку необходимо выбрать буферную систему, важно, чтобы система оставалась стабильной в условиях повышения температуры. Таким образом, мочевину для приготовления геля обычно используют ; однако исследователи должны знать, что количество используемой мочевины будет влиять на общую температуру, необходимую для разделения ДНК. [6] Гель загружается, образец помещается на гель в соответствии с типом обрабатываемого геля – т.е. параллельно или перпендикулярно – напряжение регулируется, и образец можно оставить для работы. [6] В зависимости от типа TGGE, перпендикулярного или параллельного , необходимо подготовить и загрузить различное количество проб. Большее количество одного образца используется при перпендикулярном методе, тогда как меньшее количество многих образцов используется при параллельном ТГГЭ. После того, как гель был использован, его необходимо окрасить, чтобы визуализировать результаты. Хотя для этой цели можно использовать множество красителей, окрашивание серебром . наиболее эффективным средством оказалось [6] ДНК можно элюировать из серебряного пятна для дальнейшего анализа посредством ПЦР- амплификации. [6]
Приложения
[ редактировать ]TGGE и DGGE широко используются в биомедицинских и экологических исследованиях; выбранные приложения описаны ниже.
Мутации в мтДНК
[ редактировать ]Согласно недавнему расследованию Вонга, Ляна, Квона, Бая, Альпера и Гропмана, [7] TGGE можно использовать для исследования митохондриальной ДНК человека. По мнению этих авторов, TGGE использовался для определения двух новых мутаций в митохондриальном геноме : «21-летняя женщина, у которой подозревалась митохондриальная цитопатия, но не выявила точковых мутаций и делеций общей митохондриальной ДНК (мтДНК), была обследована. для выявления неизвестных мутаций во всем митохондриальном геноме методом гель-электрофореза в градиенте температуры». [8]
Мутация р53 в секрете поджелудочной железы
[ редактировать ]Отчет Лора и его коллег (2001). [ нужна ссылка ] что при комплексном исследовании секрета поджелудочной железы у людей без рака поджелудочной железы мутации р53 можно было обнаружить в соках поджелудочной железы у небольшого процента участников. Поскольку мутации р53 широко обнаруживаются при раке поджелудочной железы, исследователи этого исследования пытались определить, может ли сама мутация быть связана с развитием рака поджелудочной железы. Хотя Лору удалось обнаружить мутации р53 с помощью TGGE у нескольких пациентов, ни у одного впоследствии не развилась карцинома поджелудочной железы. Таким образом, в заключение исследователи отмечают, что мутация р53 не может быть единственным индикатором онкогенеза рака поджелудочной железы.
Микробная экология
[ редактировать ]DGGE генов, кодирующих малые субъединицы рибосом, был впервые описан Джерардом Мьюзером , [9] в то время как он был постдоком в Лейденском университете , этот метод стал широко использоваться в микробной экологии.
ПЦР-амплификация ДНК, выделенной из смешанных микробных сообществ, с помощью ПЦР-праймеров, специфичных к фрагментам гена 16S рРНК бактерий и архей и фрагментам гена 18S рРНК эукариот , приводит к получению смесей продуктов ПЦР.Поскольку все эти ампликоны имеют одинаковую длину, их нельзя отделить друг от друга с помощью электрофореза в агарозном геле. Однако вариации последовательностей (т.е. различия в содержании и распределении GC) между разными микробными рРНК приводят к различным свойствам денатурации этих молекул ДНК.
Следовательно, шаблоны полос DGGE можно использовать для визуализации изменений в микробном генетическом разнообразии и дать приблизительную оценку богатства численности преобладающих членов микробного сообщества. Этот метод часто называют « снятием отпечатков пальцев сообщества ». Недавно несколько исследований показали, что DGGE функциональных генов (например, генов, участвующих в восстановлении серы, фиксации азота и окислении аммония) может одновременно предоставлять информацию о микробной функции и филогении. Например, Табатабаи и др. сумели выявить микробную структуру во время анаэробной ферментации сточных вод заводов по производству пальмового масла (POME). (2009) применили DGGE и впервые [10]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Ячейка. Январь 1979 г.; 16 (1): 191–200. Независимое от длины разделение рестрикционных фрагментов ДНК при двумерном гель-электрофорезе. Фишер С.Г., Лерман Л.С.
- ^ Фишер С.Г. и Лерман Л.С. «Разделение случайных фрагментов ДНК по свойствам их последовательностей» Учеб. Натл. акад. наук. США, 1980, 77, 4420-4424.
- ^ Фишер С.Г. и Лерман Л.С. «Фрагменты ДНК, различающиеся заменами одной пары оснований, разделяются в денатурирующих градиентных гелях: соответствие теории плавления» Proc. Натл. акад. наук. США, 1983, 80, 1579-1583.
- ^ J Мол Биол. 7 октября 1994 г.; 242(5):670-82. Электрофоретическая характеристика денатурированных состояний стафилококковой нуклеазы. Крейтон Т.Э., Шортл Д.
- ^ Биохимия. Дж. (1981) 197, 105-109.
- ^ Jump up to: а б с д (Биометра, 2000). [ нужна ссылка ]
- ^ L-JC Вонг, Д. Йим, Р.К. Бай, Х. Квон, М. М. Вацек, Дж. Зейн, К. Л. Хоппель и Д. С. Керр. Новая мутация в митохондриальном гене tRNASer(AGY), связанная с митохондриальной миопатией, энцефалопатией и дефицитом комплекса I. Джей Мед Жене. Стембро 2006 г.; 43(9): е46.дои: 10.1136/jmg.2005.040626. PMCID: PMC2564579. ПМИД 16950817 .
- ^ (Вонг и др., 2002). [ нужна ссылка ]
- ^ Мюйзер Г., де Ваал EC, Uitterlinden AG. (1993)Профилирование сложных микробных популяций с помощью денатурирующего градиентного гель-электрофореза, анализа амплифицированных полимеразной цепной реакцией генов, кодирующих 16S рРНК. Appl Environ Microbiol. 59:695-700.
- ^ Анализ метаногенов в анаэробном закрытом варочном котле с помощью DGGE и FISH на основе ПЦР для очистки сточных вод завода по производству пальмового масла. Мейсам Табатабаи, Мохд Рафейн Закария, Раха Абдул Рахим, Андре-Денис Дж. Райт, Ёсихито Шираи, Норхани Абдулла, Кенджи Сакаи, Шинья Икено, Масацугу Мори, Накамура Казунори, Алави Сулейман и Мохд Али Хасан, 2009, Электронный журнал биотехнологии, Том 12 №3, выпуск от 15 июля 2009 г., ISSN 0717-3458
- Чарльз Дж. Сейли, доктор медицинских наук, магистр наук. Части взяты из сводной статьи под названием «TGGE». 2003. Университет наук в Филадельфии.
| Базы данных органов управления : Национальные |
|---|
