Кленов фрагмент
Фрагмент Кленова представляет собой большой фрагмент белка образующийся при ДНК-полимеразы I из E. coli расщеплении ферментативном протеазой , субтилизин . Впервые сообщалось в 1970 г. [1] он сохраняет 5' → 3' полимеразную активность и 3' → 5' экзонуклеазную активность для удаления прекодирующих нуклеотидов и корректуры, но теряет свою 5' → 3' экзонуклеазную активность.
Другой меньший фрагмент, образующийся при расщеплении ДНК-полимеразы I из E. coli субтилизином, сохраняет экзонуклеазную активность 5' → 3', но не обладает двумя другими активностями, проявляемыми фрагментом Кленова (т.е. активностью 5' → 3'-полимеразы и 3' → 5' экзонуклеазная активность).
Исследовать
[ редактировать ]Поскольку 5' → 3'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы I из E. coli делает ее непригодной для многих применений, фрагмент Кленова, лишенный этой активности, может быть очень полезен в исследованиях. Фрагмент Кленова чрезвычайно полезен для исследовательских задач, таких как:
- Синтез двухцепочечной ДНК из одноцепочечных матриц.
- Заполнение отступающих 3'-концов фрагментов ДНК, чтобы сделать 5'-выступающий тупым.
- Устранение выступающих 3-футовых выступов
- Приготовление радиоактивных зондов ДНК
Фрагмент Кленова был также оригинальным ферментом, который использовался для значительной амплификации сегментов ДНК в процессе полимеразной цепной реакции (ПЦР). [2] перед заменой термостабильными ДНК-полимеразами, такими как Taq-полимераза . [3]
Экзо-Кленов фрагмент
[ редактировать ]5' → 3' Так же, как экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы I из E.coli активность 3' → 5' может быть нежелательной, экзонуклеазная фрагмента Кленова также может быть нежелательной для определенных применений. Эту проблему можно преодолеть путем введения мутаций в ген, кодирующий Кленов. Это приводит к тому, что экспрессируемые формы фермента сохраняют 5' → 3' полимеразную активность, но лишены какой-либо экзонуклеазной активности (5' → 3' или 3' → 5'). Эта форма фермента называется экзо-фрагментом Кленова .
Фрагмент экзо-Кленова используется в некоторых реакциях флуоресцентного мечения микроматриц, а также в хвостах dA и dT, важном этапе процесса лигирования адаптеров ДНК с фрагментами ДНК, часто используемых при подготовке библиотек ДНК для секвенирования следующего поколения. (например, см. [1] )
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Кленов Х. и Хеннингсен I (1970). «Селективное устранение экзонуклеазной активности полимеразы дезоксирибонуклеиновой кислоты из Escherichia coli B путем ограниченного протеолиза» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 65 (1): 168–175. Бибкод : 1970ПНАС...65..168К . дои : 10.1073/pnas.65.1.168 . ПМК 286206 . ПМИД 4905667 .
- ^ Сайки Р.К. и др. (1985). «Ферментативная амплификация геномных последовательностей β-глобина и анализ сайтов рестрикции для диагностики серповидноклеточной анемии». Наука . 230 (4732): 1350–54. Бибкод : 1985Sci...230.1350S . дои : 10.1126/science.2999980 . ПМИД 2999980 .
- ^ Сайки Р.К. и др. (1988). «Праймер-направленная ферментативная амплификация ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы». Наука . 239 (4839): 487–91. дои : 10.1126/science.239.4839.487 . ПМИД 2448875 .
Внешние ссылки
[ редактировать ]- Кленов + Фрагмент в Национальной медицинской библиотеке США по медицинским предметным рубрикам (MeSH)
- Схема на сайте vivo.colostate.edu