Контроль дупликации хромосом
В клеточной биологии эукариоты обладают регуляторной системой, которая гарантирует, что репликация ДНК происходит только один раз за клеточный цикл .
Ключевой особенностью механизма репликации ДНК у эукариот является то, что он предназначен для репликации относительно больших геномов быстрой и точной . Репликация инициируется в нескольких точках начала репликации на нескольких хромосомах одновременно, так что продолжительность S-фазы не ограничивается общим количеством ДНК . [ 1 ] За такую гибкость размера генома приходится платить: должна существовать высокоточная система управления, которая координирует несколько источников репликации, чтобы они активировались только один раз во время каждой S-фазы . Если бы это было не так, дочерние клетки могли бы унаследовать чрезмерное количество любой последовательности ДНК, что могло бы привести ко многим вредным последствиям. [ 2 ]
Начало репликации
[ редактировать ]Репликация у эукариот начинается в точках начала репликации, где комплексы белков- инициаторов связывают и раскручивают спираль . [ 3 ] У эукариот до сих пор неясно, какие именно комбинации последовательности ДНК, структуры хроматина и других факторов определяют эти сайты. Относительный вклад этих факторов варьируется в зависимости от организма. Происхождение дрожжей определяется в первую очередь мотивами последовательности ДНК, тогда как местоположение происхождения в других организмах, по-видимому, определяется локальной структурой хроматина. [ 3 ]
Дрожжи
[ редактировать ]Происхождение у почкующихся дрожжей определяется автономно реплицирующейся последовательностью (ARS), коротким участком ДНК (100–200 пар оснований), который может инициировать репликацию при переносе на любую последовательность ДНК. [ 3 ] [ 4 ] ARS содержит несколько конкретных элементов последовательности. Одним из них является элемент A (ACS), консенсусная последовательность длиной 11 пар оснований, богатая аденинами и тиминами, которая необходима для инициации. Мутации одной пары оснований в ACS могут отменить инициирующую активность. [ 3 ] [ 5 ] ORC, компонент инициирующего комплекса, связывает ACS in vivo на протяжении клеточного цикла и in vitro зависимым образом АТФ- . Когда некоторые из этих последовательностей удаляются, ДНК по-прежнему копируется из других неповрежденных источников, но когда удаляются многие из них, репликация хромосом резко замедляется. [ 3 ] Тем не менее, наличие последовательности ACS недостаточно для идентификации источника репликации. Лишь около 30% последовательностей ACS, присутствующих в геноме, являются сайтами инициации активности. [ 4 ] Происхождение у делящихся дрожжей содержит длинные участки ДНК, богатые тиминами и аденинами, которые важны для функции происхождения, но не демонстрируют сильного сходства последовательностей. [ 3 ]
Животные
[ редактировать ]У животных не обнаружено высококонсервативных элементов последовательности, которые могли бы управлять активностью ориджина, и оказалось трудно идентифицировать общие особенности ориджина репликации. В некоторых локусах инициация происходит в пределах небольших, относительно определяемых участков ДНК, тогда как в других более крупные зоны инициации размером 10–50 т.п.н., по-видимому, управляют активностью происхождения. [ 3 ] На уровне последовательностей в источниках были обнаружены богатые АТ элементы и CpG-островки, но их важность или роль еще не ясна. На уровне структуры ДНК изогнутая ДНК и образование петель были идентифицированы как особенности происхождения. Особенности, идентифицированные на уровне хроматина, включают свободные от нуклеосом области, ацетилирование гистонов и сайты, чувствительные к ДНКазе . [ 4 ]
Пререпликационный комплекс
[ редактировать ]
Прежде чем репликация ДНК может начаться, пререпликативный комплекс собирается в начале и загружает хеликазу в ДНК. Комплекс собирается в конце митоза и начале G1 . Сборка этих пререпликативных комплексов (пре-РК) регулируется таким образом, что координирует репликацию ДНК с клеточным циклом . [ 6 ]
Компоненты предварительного РК
[ редактировать ]ОРЦ
[ редактировать ]ORC представляет собой комплекс из шести субъединиц, который связывает ДНК и обеспечивает участок на хромосоме, где могут собираться дополнительные факторы репликации. Он был идентифицирован у S. cerevisiae по его способности связывать консервативные элементы A и B1 дрожжевого происхождения. Это консервативная особенность системы репликации у эукариот. [ 6 ] Исследования на дрозофиле показали, что рецессивные летальные мутации в нескольких субъединицах ORC дрозофилы уменьшают количество включенного BrdU (маркера активной репликации). [ 7 ] Исследования экстрактов Xenopus показывают, что иммуноистощение субъединиц ORC ингибирует репликацию ДНК ядер сперматозоидов Xenopus . У некоторых организмов ORC, по-видимому, связывается с хроматином на протяжении всего клеточного цикла, но у других он диссоциирует на определенных стадиях клеточного цикла. [ 6 ]
Cdc6 и Cdt1
[ редактировать ]Cdc6 и Cdt1 собираются на ORC и рекрутируют белки Mcm. [ 3 ] Гомологи этих двух белков S. cerevisiae обнаружены у всех эукариот. [ 3 ] Исследования показали, что эти белки необходимы для репликации ДНК . Мутации cdt1 S. pombe блокировали репликацию ДНК. [ 6 ]
Комплекс МСМ
[ редактировать ]Mcm 2–7 образуют комплекс из шести субъединиц и, как полагают, обладают геликазной активностью. [ 2 ] Делеция любой отдельной субъединицы комплекса имеет летальный фенотип у дрожжей. [ 6 ] Исследования на Xenopus показали, что комплекс Mcm2-7 является важнейшим компонентом механизма репликации ДНК . [ 6 ] Инактивация чувствительных к температуре мутантов любого из белков Mcm в «S. cerevisiae» приводила к остановке репликации ДНК , если инактивация произошла во время S-фазы, и предотвращала инициацию репликации, если инактивация произошла раньше. [ 6 ] Хотя биохимические данные подтверждают гипотезу о том, что комплекс Mcm представляет собой хеликазу , хеликазная активность обнаружена не у всех видов, а некоторые исследования позволяют предположить, что некоторые субъединицы mcm действуют вместе как геликаза, тогда как другие субъединицы действуют как ингибиторы этой активности. Если это правда, то активация комплекса Mcm, вероятно, включает перестановку субъединиц. [ 6 ]
Регламент сборки предРК комплекса
[ редактировать ]
Двухэтапный механизм гарантирует, что ДНК реплицируется только один раз за цикл. Сборка комплекса pre-RC (лицензирование) ограничена поздним митозом и ранним G1, поскольку она может происходить только тогда, когда активность CDK низкая, а активность APC высокая. Исходное срабатывание происходит только в фазе S, когда APC деактивирован и CDK активированы. [ 1 ]
Дрожжи
[ редактировать ]У почкующихся дрожжей CDK является ключевым регулятором сборки pre-RC. [ 3 ] Доказательством этого является то, что инактивация CDK в клетках, арестованных в G2/M или в S-фазе, приводит к повторной сборке pre-RCs. [ 1 ] CDK действует путем ингибирования отдельных компонентов пре-РК. CDK фосфорилирует Cdc6, чтобы пометить его для деградации SCF в поздней G1 и ранней S-фазе. [ 1 ] CDK также индуцирует экспорт комплексов Mcm и Cdt1 из ядра. [ 1 ] Доказательством того, что CDK регулируют локализацию Mcm2-7, является то, что инактивация CDK в клетках, арестованных нокодазолом , индуцирует накопление Mcm2-7 в ядре. [ 1 ] Cdt1 также экспортируется, поскольку он связывается с комплексом Mcm. В клетках, обедненных Mcm, Cdt1 не накапливался в ядре. И наоборот, когда сигнал ядерной локализации был прикреплен к Mcm7, Mcm2-7 и Cdt1 всегда обнаруживались в ядре. [ 1 ] Экспорт Mcm из ядра предотвращает загрузку новых комплексов Mcm, но не влияет на комплексы, которые уже были загружены в ДНК. [ 3 ] CDK также фосфорилирует белки ORC. Было высказано предположение, что фосфорилирование влияет на способность ORC связывать другие компоненты пре-RC. [ 3 ] Чтобы добиться существенной повторной репликации ДНК, необходимо предотвратить регуляцию всех трех компонентов: Cdc6, Mcm2-7 и ORC. Наличие нескольких механизмов для предотвращения повторной репликации выгодно, поскольку регулирующая сеть продолжает функционировать, даже если один из компонентов выходит из строя. [ 3 ]
Животные
[ редактировать ]Геминин является важным ингибитором сборки pre-Rc в клетках многоклеточных животных. [ 3 ] Геминин был идентифицирован при скрининге субстратов APC/C у Xenopus . [ 8 ] Исследования показали, что Geminin предотвращает сборку pre_RC, связываясь с cdt1 и предотвращая его ассоциацию с pre-RC. [ 9 ] Поскольку геминин разрушается под действием APC/C, сборка pre-Rc может продолжаться только тогда, когда активность APC/C высока, что происходит в G1. [ 1 ] Важность CDK в предотвращении повторного лицензирования в клетках многоклеточных животных до сих пор неясна. Некоторые исследования показали, что при некоторых условиях CDK также могут способствовать лицензированию. В клетках млекопитающих G0 деградация Cdc6, опосредованная APC, предотвращает лицензирование. Однако, когда клетки переходят в пролиферативное состояние, CDK фосфорилирует Cdc6, чтобы стабилизировать его и позволить ему накапливаться и связываться с источниками до того, как накапливаются ингибиторы лицензирования, такие как геминин. [ 10 ]
Активация ориджинов репликации
[ редактировать ]
В то время как комплексы pre-RC отмечают потенциальные сайты для активации ориджина, дальнейшие белки и комплексы должны собираться в этих сайтах, чтобы активировать репликацию (активация ориджина). Для активации ориджина должны произойти следующие события: спираль ДНК должна раскрыться, геликаза должна активироваться, а ДНК-полимеразы и остальная часть репликативного механизма должны загрузиться в ДНК. [ 3 ] Эти события зависят от сборки нескольких белков с образованием преинициативного комплекса в точках начала репликации, загруженного пререпликативными комплексами. [ 3 ] Сборка преинициаторного комплекса зависит от активности S-Cdks и протеинкиназы Cdc7. Комплекс преинициации активирует геликазу Mcm и рекрутирует ДНК-полимеразу. [ 3 ] Когда клетка переходит в новый клеточный цикл после прохождения контрольной точки начала, активируются комплексы циклина CDK G1 и G1/S. Они активируют экспрессию репликативного аппарата и комплексов S-Cdk цилиндр. S-Cdks и G1/S Cdks активируют источники репликации. [ 6 ] В то же время S-Cdks подавляют образование новых пре-РК во время S-фазы, G2 и ранней М, когда уровни S-циклина остаются высокими. Cdc7 активируется в конце G1 и необходим на протяжении всей фазы S для исходной активации. Мутации этого белка у почкующихся дрожжей и его гомолога у делящихся дрожжей блокируют инициацию репликации. Cdc7 высококонсервативен: родственные ему белки были идентифицированы у лягушек и людей. Репликация ДНК ингибируется, когда гомологи Cdc7 ингибируются антителами в клетках лягушки или человека. Неизвестно, регулируют ли CDK и Cdc7 только сборку белка в начале или они напрямую активируют компоненты преинициаторного комплекса. [ 6 ]
Роль CdK
[ редактировать ]У S. cerevisiae S-циклины Clb5 и Clb6 играют важную роль в инициации репликации. У эмбрионов лягушки за активацию ориджинов в первую очередь отвечает циклин E-Cdk2. Удаление циклина Е антителами блокирует репликацию. Циклин E-CDk2 также важен для дрозофилы . Уровни циклина E повышаются во время фазы S и активируют Cdk2. [ 6 ]
Роль Cdc7
[ редактировать ]Уровни Cdc7 остаются относительно постоянными на протяжении всего клеточного цикла, но его активность варьируется. Его активность низкая в G1, возрастает в конце G1 и остается высокой до позднего митоза. Dbf4 является ключевым регулятором активности Cdc7 – ассоциация Cdc7 с Dbf4 активирует его киназную активность. Подобно уровням циклина, уровни dbf4 колеблются на протяжении клеточного цикла. [ 6 ] Биохимические исследования in vitro показали, что Cdc7-Dbf4 фосфорилирует отдельные компоненты комплекса Mcm. Он также, по-видимому, участвует в рекрутировании Cdc45 в хроматин во время инициации. Было показано, что в яйцах Xenopus Cdc45 взаимодействует с ДНК-полимеразой α, а у дрожжей мутации в Cdc45 предотвращают сборку ДНК pol α в источниках, что позволяет предположить, что Cdc45 рекрутирует ДНК pol α в хроматин зависимым от Cdc7/Dbf4 способом. [ 3 ] [ 6 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с д и ж г час Диффли, Дж. Ф. (2008). «Регуляция ранних событий репликации хромосом» . Курс. Биол . 14 (18): Р778–Р786. дои : 10.1016/j.cub.2004.09.019 . ПМИД 15380092 .
- ^ Jump up to: а б Кирси, SE; Коттерил, С. (2003). «Загадочные вариации: разные способы регулирования репликации ДНК эукариот» . Мол. Клетка . 12 (5): 1067–1075. дои : 10.1016/S1097-2765(03)00441-6 . ПМИД 14636567 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж г час я дж к л м н тот п д р Дэвид Оуэн Морган (2007). Клеточный цикл: принципы управления . Новая научная пресса. ISBN 978-0-19-920610-0 .
- ^ Jump up to: а б с Мечали, М. (2010). «Происхождение репликации эукариотической ДНК: множество вариантов подходящих ответов». Nature Reviews Молекулярно-клеточная биология . 11 (10): 728–738. дои : 10.1038/nrm2976 . ПМИД 20861881 .
- ^ Гилберт, DM (2001). «Понимание происхождения репликации эукариот» . Наука . 294 (5540): 96–100. дои : 10.1126/science.1061724 . ПМЦ 1255916 . ПМИД 11588251 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж г час я дж к л м Белл, СП; Датта, А. (2002). «Репликация ДНК в эукариотических клетках». Анну. Преподобный Биохим . 71 : 333–374. doi : 10.1146/annurev.biochem.71.110601.135425 . ПМИД 12045100 .
- ^ Пфлумм, МФ; Бохтан, MR (2001). «Мутанты орков арестовываются в метафазе с аномально конденсированными хромосомами». Разработка . 128 (9): 1697–1707. ПМИД 11290306 .
- ^ Ти Джей МакГарри; М.В. Киршнер (1998). «Геминин, ингибитор репликации ДНК, разрушается во время митоза» . Клетка . 93 (6): 1043–1053. doi : 10.1016/S0092-8674(00)81209-X . ПМИД 9635433 .
- ^ Й. А. Вольшлегель; Б.Т. Дуайер; СК Дхар; К. Цветич; Джей Си Уолтер; А. Дутта (2000). «Ингибирование репликации эукариотической ДНК путем связывания геминина с Cdt1». Наука . 290 (5500): 2309–2312. дои : 10.1126/science.290.5500.2309 . ПМИД 11125146 .
- ^ Мейленд, Н.; Диффли Дж. Ф. (2005). «CDK способствуют лицензированию начала репликации ДНК в клетках человека, способствуя Cdc6 в результате APC/C-зависимого протеолиза» . Клетка . 122 (6): 915–926. дои : 10.1016/j.cell.2005.08.013 . ПМИД 16153703 .