ДНК
| ДНК-примаза | |||
|---|---|---|---|
| Идентификаторы | |||
| Организм | |||
| Символ | ДНК | ||
| Альт. символы | днаП | ||
| Входить | 947570 | ||
| ПДБ | 1D0Q, 1DD9, 1DDE, 1EQ9, 2R6A, 2R6C | ||
| RefSeq (защита) | НП_417538 | ||
| ЮниПрот | P0ABS5 | ||
| Другие данные | |||
| Номер ЕС | 2.7.7.7 | ||
| хромосома | хромосома: 3,21 – 3,21 Мб | ||
| |||
DnaG представляет собой бактериальную ДНК- примазу и кодируется геном dnaG . Фермент DnaG и любая другая ДНК-примаза синтезируют короткие цепи РНК, известные как олигонуклеотиды, во время репликации ДНК . Эти олигонуклеотиды известны как праймеры , поскольку они служат отправной точкой для синтеза ДНК. DnaG катализирует синтез олигонуклеотидов длиной от 10 до 60 нуклеотидов (фундаментальная единица ДНК и РНК), однако большинство синтезируемых олигонуклеотидов имеют длину 11 нуклеотидов. [ 1 ] Эти олигонуклеотиды РНК служат праймерами или отправными точками для синтеза ДНК бактериальной ДНК-полимеразой III (Pol III). DnaG важен для репликации бактериальной ДНК, поскольку ДНК-полимераза не может инициировать синтез цепи ДНК, а может только добавлять нуклеотиды к уже существующей цепи. [ 2 ] DnaG синтезирует один праймер РНК в начале репликации . Этот праймер служит для запуска синтеза ведущей цепи ДНК. Для другой родительской цепи, отстающей , DnaG синтезирует праймер РНК каждые несколько тысяч оснований (кб). Эти праймеры служат субстратами для синтеза фрагментов Оказаки . [ 3 ]
В E. coli DnaG связывается посредством нековалентных взаимодействий с бактериальной репликативной хеликазой DnaB для осуществления своей примазной активности, при этом три белка-примазы DnaG связываются с каждой хеликазой DnaB с образованием примосомы . [ 4 ] Примазы имеют тенденцию инициировать синтез в определенных трех нуклеотидных последовательностях на матрицах одноцепочечной ДНК (оцДНК), а для DnaG E. coli последовательность представляет собой 5'-CTG-3'. [ 1 ]
DnaG содержит три отдельных белковых домена : домен связывания цинка, домен РНК-полимеразы и домен связывания геликазы DnaB. Есть несколько бактерий, которые используют ДНК-примазу DnaG. Некоторыми организмами, которые имеют DnaG в качестве примазы ДНК, являются Escherichia coli ( E. coli ), Bacillus stearothermophilus и Mycobacterium Tuberculosis (MTB). DnaG E. coli имеет молекулярную массу 60 килодальтон (кДа) и содержит 581 аминокислоту .
Функция
[ редактировать ]
DnaG катализирует синтез олигонуклеотидов в пять отдельных этапов: связывание матрицы, связывание нуклеозидтрифосфата (NTP), инициация, удлинение с образованием праймера и перенос праймера на ДНК-полимеразу III. [ 1 ] DnaG осуществляет этот катализ вблизи репликационной вилки , которая образуется хеликазой DnaB во время репликации ДНК. DnaG должен образовывать комплекс с DnaB, чтобы катализировать образование олигонуклеотидных праймеров. [ 1 ]
Механизм синтеза праймеров примазами включает два сайта связывания NTP на белке примазы (DnaG). [ 5 ] До связывания каких-либо NTP с образованием праймера РНК последовательность матрицы оцДНК связывается с DnaG. ОцДНК содержит последовательность распознавания из трех нуклеотидов, которая рекрутирует NTP на основе спаривания оснований Уотсона-Крика . [ 1 ] После связывания ДНК DnaG должен связать два NTP, чтобы образовать четверичный комплекс фермент-ДНК-NTP-NTP. Константа Михаэлиса (км) для NTP варьируется в зависимости от примазы и матрицы. [ 6 ] Два сайта связывания NTP на DnaG называются сайтом инициации и сайтом элонгации. Сайт инициации представляет собой сайт, в котором NTP должен быть включен на 5'-конце праймера. Сайт элонгации связывает NTP, который добавляется к 3'-концу праймера.
Как только два нуклеотида связываются с примазой, DnaG катализирует образование динуклеотида путем образования фосфодиэфирной связи посредством дегидратационного синтеза между 3'-гидроксилом нуклеотида в сайте инициации и α-фосфатом нуклеотида в сайте элонгации. Эта реакция приводит к образованию динуклеотида и разрыву связи между α и β фосфором с высвобождением пирофосфата. Эта реакция необратима, поскольку образующийся пирофосфат гидролизуется на две молекулы неорганического фосфата под действием фермента неорганической пирофосфатазы . [ 7 ] Эта реакция синтеза динуклеотидов аналогична реакции любого другого фермента, катализирующего образование ДНК или РНК ( ДНК-полимераза , РНК-полимераза ), поэтому DnaG всегда должен синтезировать олигонуклеотиды в направлении от 5' к 3'. В E. coli праймеры начинаются с трифосфат-аденин-гуанинового (pppAG) динуклеотида на 5'-конце.
Чтобы произошло дальнейшее удлинение динуклеотида, олигонуклеотид должен быть перемещен так, чтобы 3'-NTP перенесся из сайта элонгации в сайт инициации, позволяя другому NTP связаться с сайтом элонгации и прикрепиться к 3'-гидроксилу динуклеотида. олигонуклеотид. После того, как олигонуклеотид соответствующей длины был синтезирован на этапе элонгации синтеза праймера, DnaG передает вновь синтезированный праймер ДНК-полимеразе III, чтобы она синтезировала ведущую цепь ДНК или фрагменты Оказаки для отстающей цепи. [ 1 ] Стадия, ограничивающая скорость синтеза праймера, происходит после связывания NTP, но до или во время синтеза динуклеотидов. [ 6 ]
Структура
[ редактировать ]Согласно исследованиям протеолиза, примаза E. Coli DnaG представляет собой мономерный белок из 581 остатка с тремя функциональными доменами. Существует N-концевой цинк-связывающий домен (остатки 1–110), в котором ион цинка тетраэдрически координирован между одним гистидиновым и тремя цистеиновыми остатками, что играет роль в распознавании сайтов связывания ДНК, специфичных для последовательности. Центральный домен (остатки 111–433) проявляет активность РНК-полимеразы и является местом синтеза праймера РНК. С-концевой домен (остатки 434–581) отвечает за нековалентное связывание DnaG с белком- хеликазой DnaB . [ 8 ]
Цинк-связывающий домен
[ редактировать ]
Цинк-связывающий домен, домен, ответственный за распознавание участков связывания ДНК, специфичных для последовательности, консервативен во всех вирусных, бактериофаговых, прокариотических и эукариотических ДНК-примазах. [ 9 ] Цинк-связывающий домен примазы является частью подсемейства цинк-связывающих доменов, известного как цинковая лента . Домены цинковой ленты характеризуются двумя петлями β-шпильки , которые образуют цинксвязывающий домен. Обычно считается, что домены цинковых лент не имеют α-спиралей , что отличает их от других цинксвязывающих доменов. Однако в 2000 году цинксвязывающий домен DnaG был кристаллизован из Bacillus stearothermophilus, что этот домен состоит из пятинитевого антипараллельного β-листа , примыкающего к четырем α-спирали и 3–10 и было обнаружено , спирали на С-концевом конце домена. [ 9 ]
Сайт связывания цинка B. stearothermophilus состоит из трех остатков цистеина, Cys40, Cys61 и Cys64, и одного остатка гистидина, His43. Cys40 и His43 расположены на β-шпильке между вторым и третьим β-листом. [ 9 ] Cys61 расположен на пятом β-листе, а Cys64 — на β-шпильке между четвертым и пятым β-листами. Эти четыре остатка тетраэдрически координируют ион цинка. Считается, что ион цинка стабилизирует петли между вторым и третьим β-листами, а также четвертым и пятым β-листами. Домен дополнительно стабилизируется за счет ряда гидрофобных взаимодействий между гидрофобной внутренней поверхностью β-листа, который упакован напротив второй и третьей α-спиралей. На внешней поверхности β-листа также имеется множество консервативных гидрофобных и основных остатков. Этими остатками являются Lys30, Arg34, Lys46, Pro48, Lys56, Ile58, His60 и Phe62. [ 9 ]
Связывание ДНК
[ редактировать ]Считается, что функция цинксвязывающего домена заключается в распознавании последовательности ДНК. ДНК-примазы создают праймеры для РНК, которые затем используются для синтеза ДНК. Размещение праймеров РНК не является случайным, что позволяет предположить, что они расположены на определенных последовательностях ДНК. Действительно, было показано, что другие примазы ДНК распознают триплетные последовательности; специфическая последовательность, распознаваемая B. stearothermophilus , еще не идентифицирована. [ 9 ] Было показано, что при мутации остатков цистина, координирующих ион цинка, ДНК-примаза перестает функционировать. Это указывает на то, что цинк-связывающий домен действительно играет роль в распознавании последовательности. Кроме того, гидрофобная поверхность β-листа, а также основные остатки, которые сгруппированы преимущественно на одном крае листа, служат для привлечения одноцепочечной ДНК, что еще больше облегчает связывание ДНК. [ 9 ]
На основании предыдущих исследований связывания ДНК ДНК-примазами считается, что ДНК связывается с цинк-связывающим доменом по всей поверхности β-листа, при этом три нуклеотида связываются по трем нитям β-листа. [ 9 ] Положительно заряженные остатки в листе смогут образовывать контакты с фосфатами, а ароматические остатки будут образовывать штабелирующие взаимодействия с основаниями. Это модель связывания ДНК с помощью оцДНК-связывающего домена репликационного белка А (RPA) . [ 9 ] Логично предположить, что цинксвязывающий домен B. stearothermophilus связывает ДНК аналогичным образом, поскольку остатки, важные для связывания ДНК в RPA, находятся в структурно эквивалентных положениях у B. stearothermophilus . [ 9 ]
РНК-полимеразный домен
[ редактировать ]
Как следует из названия, домен РНК-полимеразы (РНКП) DnaG отвечает за синтез праймеров РНК на одноцепочечной ДНК. In vivo DnaG способен синтезировать фрагменты праймеров длиной до 60 нуклеотидов, но фрагменты праймеров in vivo ограничены примерно 11 нуклеотидами. [ 10 ] Во время синтеза отстающей цепи DnaG синтезирует от 2000 до 3000 праймеров со скоростью один праймер в секунду. [ 10 ]
РНКП-домен DnaG состоит из трех субдоменов: N-концевого домена, который имеет смешанную α- и β-складку, центрального домена, состоящего из 5-нитевого β-листа и 6 α-спиралей, и, наконец, С-концевого домена, состоящего из спиральный пучок, состоящий из трех антипараллельных α-спиралей. Центральный домен образован частью складки топрима , складки, которая наблюдается во многих металлсвязывающих фосфопереносящих белках. Центральный домен и N-концевой домен образуют неглубокую щель, которая составляет активный центр удлинения цепи РНК в DnaG. [ 10 ] Устье щели выстлано несколькими высококонсервативными основными остатками: Arg146, Arg221 и Lys229. Эти остатки являются частью электростатически положительного гребня N-концевого субдомена. Именно этот гребень взаимодействует с оцДНК и помогает направлять ее в щель, которая состоит из металлосвязывающего центра мотива toprim на центральном субдомене и консервативных мотивов примазы N-концевого домена. [ 10 ] Сайт связывания металла домена toprim — это место, где синтезируется праймер. Дуплекс РНК:ДНК затем выходит через еще одну базовую депрессию.
C-концевой домен
[ редактировать ]
В отличие как от цинксвязывающих доменов, так и от доменов РНК-полимеразы, С-концевые домены ДНК-примаз не консервативны. У прокариотических примаз единственная известная функция этого домена — взаимодействие с хеликазой DnaB. [ 1 ] Таким образом, этот домен называется доменом связывания геликазы (HBD). HBD DnaG состоит из двух субдоменов: спирального пучка , субдомена C1, и спиральной шпильки, субдомена C2. [ 4 ] [ 11 ] Для каждой из двух-трех молекул DnaG, связывающих гексамер DnaB, субдомены C1 HBD взаимодействуют с DnaB в его N-концевых доменах на внутренней поверхности гексамерного кольца, а субдомены C2 взаимодействуют с N-концевыми доменами. на внешней поверхности гексамера.
Три остатка в DnaB B. stearothermophilus были идентифицированы как важные для формирования интерфейса DnaB и DnaG. Эти остатки включают Tyr88, Ile119 и Ile125. [ 4 ] Tyr88 находится в непосредственной близости от HBD DnaG, но не вступает с ним в контакт. Мутация Tyr88 ингибирует образование спирального пучка N-концевого домена DnaB, прерывая контакты с HBD DnaG. [ 4 ] Гексамерная структура DnaB на самом деле представляет собой тример димеров. И Ile119, и Ile125 похоронены в димерном интерфейсе N-концевого домена DnaB, и мутация этих остатков ингибирует образование гексамерной структуры и, следовательно, взаимодействие с DnaG. [ 4 ] Еще одним остатком, который, как было установлено, играет решающую роль во взаимодействии DnaB и DnaG, является Glu15. Мутация Glu15 не нарушает образование комплекса DnaB, DnaG, а вместо этого играет роль в модуляции длины праймеров, синтезируемых DnaG. [ 4 ]
Ингибирование DnaG
[ редактировать ]
Ингибиторы ДНК-примаз являются ценными соединениями для выяснения биохимических путей и ключевых взаимодействий, но они также представляют интерес как ведущие соединения для разработки лекарств против бактериальных заболеваний. Большинство соединений, которые, как известно, ингибируют примазы, представляют собой аналоги нуклеотидов , такие как АраАТФ (см. Видарабин ) и 2-фтор-АраАТФ. Эти соединения часто используются примазой в качестве субстратов, но после их включения синтез или элонгация больше не могут происходить. Например, DnaG E. coli будет использовать 2',3'-дидезоксинуклеозид-5'-трифосфаты (ddNTP) в качестве субстратов, которые действуют как терминаторы цепи из-за отсутствия 3'-гидроксила для образования фосфодиэфирной связи со следующим нуклеотидом. [ 1 ]
Относительно небольшое количество ингибиторов примазы, вероятно, отражает сложность анализа примазы, а не отсутствие потенциальных сайтов связывания на ферменте. Короткая длина синтезируемых продуктов и, как правило, низкая скорость фермента по сравнению с другими ферментами репликации затрудняют разработку подходов высокопроизводительного скрининга (HTS). [ 6 ] Несмотря на трудности, известно несколько ингибиторов DnaG, не являющихся аналогами NTP. Доксорубицин и сурамин являются конкурентными ингибиторами ДНК и NTP микобактерии туберкулеза DnaG. [ 12 ] Также известно, что сурамин ингибирует примазу эукариотической ДНК, конкурируя с GTP, поэтому сурамин, вероятно, ингибирует DnaG по аналогичному механизму. [ 1 ]
Внешние ссылки
[ редактировать ]- dnaG+белок,+E+coli в Национальной медицинской библиотеке США по медицинским предметным рубрикам (MeSH)
- DnaG + (Primase) в Национальной медицинской библиотеке США по медицинским предметным рубрикам (MeSH)
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с д и ж г час я Фрик Д.Н., Ричардсон CC (2001). «ДНК-примаза». Ежегодный обзор биохимии . 70 : 39–80. doi : 10.1146/annurev.biochem.70.1.39 . ПМИД 11395402 . S2CID 33197061 .
- ^ Рассел П. (2009). iGenetics: молекулярный подход (3-е изд.). Бенджамин Каммингс. стр. 42–43. ISBN 978-0321772886 .
- ^ Нельсон Д., Кокс М. (2008). Ленингерские принципы биохимии (5-е изд.). Нью-Йорк: WH Freeman and Company. стр. 986–989 . ISBN 978-0716771081 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж Бейли С., Элиасон В.К., Стейц Т.А. (19 октября 2007 г.). «Структура гексамерной DnaB-хеликазы и ее комплекса с доменом DnaG-примазы» . Наука . 318 (5849): 459–63. Бибкод : 2007Sci...318..459B . дои : 10.1126/science.1147353 . ПМИД 17947583 .
- ^ Фрик Д.Н., Кумар С., Ричардсон CC (10 декабря 1999 г.). «Взаимодействие рибонуклеозидтрифосфатов с геном 4-примазы бактерифага Т7» . Журнал биологической химии . 274 (50): 35899–907. дои : 10.1074/jbc.274.50.35899 . ПМИД 10585475 .
- ^ Jump up to: а б с Кухта Р.Д., Стенгель Г. (май 2010 г.). «Механизм и эволюция ДНК-примас» . Biochimica et Biophysical Acta (BBA) - Белки и протеомика . 1804 (5): 1180–9. дои : 10.1016/j.bbapap.2009.06.011 . ПМК 2846230 . ПМИД 19540940 .
- ^ Брюс П.Я. (2007). Органическая химия (5-е изд.). Pearson Education, Inc., стр. 1202–1203. ISBN 978-0-13-199631-1 .
- ^ Воэт, Дональд (2010). Биохимия (4-е изд.). Нью-Йорк: Дж. Уайли и сыновья. п. 1189 . ISBN 978-0-470-57095-1 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж г час я Пан Х., Вигли Д.Б. (15 марта 2000 г.). «Структура цинксвязывающего домена ДНК-примазы Bacillus stearothermophilus» . Структура . 8 (3): 231–9. дои : 10.1016/S0969-2126(00)00101-5 . ПМИД 10745010 .
- ^ Jump up to: а б с д Кек Дж.А., Рош Д.Д., Линч А.С., Бергер Дж.М. (31 марта 2000 г.). «Структура РНК-полимеразного домена примазы E. coli». Наука . 287 (5462): 2482–6. Бибкод : 2000Sci...287.2482K . дои : 10.1126/science.287.5462.2482 . ПМИД 10741967 . S2CID 27005599 .
- ^ Окли А.Дж., Лоша К.В., Шеффер П.М., Лиепиньш Э., Пинтакуда Г., Уилс М.К.Дж., Оттинг Г., Диксон Н.Е. (15 января 2005 г.). «Кристаллические структуры и растворы геликазо-связывающего домена примазы Escherichia coli » . Журнал биологической химии . 280 (12): 11495–11504. дои : 10.1074/jbc.M412645200 . ПМИД 15649896 .
- ^ Бисвас Т., Ресто-Ролдан Э., Сойер С.К., Арцимович И., Цодиков О.В. (декабрь 2012 г.). «Новый нерадиоактивный анализ активности примазы-пирофосфатазы и его применение для открытия ингибиторов примазы DnaG микобактерий туберкулеза» . Исследования нуклеиновых кислот . 41 (4): е56. дои : 10.1093/nar/gks1292 . ПМЦ 3575809 . ПМИД 23267008 .