Jump to content

олигонуклеотид

(Перенаправлено с Олигонуклеотиды )

Олигонуклеотиды — это короткие ДНК или РНК молекулы , олигомеры , которые имеют широкий спектр применения в генетическом тестировании , исследованиях и судебной экспертизе . Обычно изготавливается в лаборатории методом твердофазного химического синтеза . [1] Эти небольшие фрагменты нуклеиновых кислот могут быть изготовлены в виде одноцепочечных молекул с любой заданной пользователем последовательностью, и поэтому они жизненно важны для синтеза искусственных генов , полимеразной цепной реакции (ПЦР), секвенирования ДНК , молекулярного клонирования и в качестве молекулярных зондов . В природе олигонуклеотиды обычно встречаются в виде небольших молекул РНК, которые участвуют в регуляции экспрессии генов (например, микроРНК ). [2] или являются промежуточными продуктами деградации, полученными в результате распада более крупных молекул нуклеиновой кислоты.

Олигонуклеотиды характеризуются последовательностью нуклеотидных остатков , составляющих всю молекулу. Длину олигонуклеотида обычно обозначают « -mer » (от греческого meros — «часть»). Например, олигонуклеотид из шести нуклеотидов (нт) представляет собой гексамер, тогда как олигонуклеотид из 25 нуклеотидов обычно называют «25-мером». Олигонуклеотиды легко связываются специфичным для последовательности образом с соответствующими комплементарными олигонуклеотидами, ДНК или РНК, образуя дуплексы или, реже, гибриды более высокого порядка. Это основное свойство служит основой для использования олигонуклеотидов в качестве зондов для обнаружения специфических последовательностей ДНК или РНК. Примеры процедур, в которых используются олигонуклеотиды, включают ДНК-микрочипы , Саузерн-блоттинг , анализ ASO , [3] флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), ПЦР и синтез искусственных генов.

Олигонуклеотиды состоят из 2'-дезоксирибонуклеотидов (олигодезоксирибонуклеотидов), которые можно модифицировать в основной цепи или в положении 2'-сахара для достижения различных фармакологических эффектов. Эти модификации придают олигонуклеотидам новые свойства и делают их ключевым элементом антисмысловой терапии . [4] [5]

Олигонуклеотиды химически синтезируются с использованием строительных блоков, защищенных фосфорамидитов природных или химически модифицированных нуклеозидов или, в меньшей степени, ненуклеозидных соединений. Сборка олигонуклеотидной цепи происходит в направлении от 3' к 5' в соответствии с обычной процедурой, называемой «синтетическим циклом». Завершение одного синтетического цикла приводит к добавлению одного нуклеотидного остатка к растущей цепи. Выход менее 100% каждой стадии синтеза и возникновение побочных реакций устанавливают практические пределы эффективности процесса. В целом олигонуклеотидные последовательности обычно короткие (длиной 13–25 нуклеотидов). [6] Максимальная длина синтетических олигонуклеотидов едва превышает 200 нуклеотидных остатков. ВЭЖХ и другие методы можно использовать для выделения продуктов с желаемой последовательностью. [ нужна ссылка ]

Химические модификации

[ редактировать ]

Создание химически стабильных коротких олигонуклеотидов было самой ранней задачей в разработке терапии АСО. Встречающиеся в природе олигонуклеотиды легко разлагаются нуклеазами — ферментом, который расщепляет нуклеотиды и которого достаточно во всех типах клеток. [7] Короткие олигонуклеотидные последовательности также обладают слабой внутренней аффинностью связывания, что способствует их деградации in vivo. [8]

Модификации магистрали

[ редактировать ]

Нуклеозидорганотиофосфатные ( ПС ) аналоги нуклеотидов придают олигонуклеотидам некоторые полезные свойства. Ключевыми полезными свойствами, которые каркас PS придает нуклеотидам, являются идентификация диастереомера каждого нуклеотида и способность легко следить за реакциями с участием фосфоротиоатных нуклеотидов, что полезно при синтезе олигонуклеотидов. [9] Модификации скелета PS олигонуклеотидов защищают их от нежелательной деградации ферментами. [10] Модификация нуклеотидного остова широко используется, поскольку ее можно относительно легко и точно осуществить для большинства нуклеотидов. [9] Сообщалось, что флуоресцентные модификации на 5'- и 3'-концах олигонуклеотидов позволяют оценить структуру, динамику и взаимодействие олигонуклеотидов по отношению к окружающей среде. [11]

Модификации сахарного кольца

[ редактировать ]

Другой модификацией олигонуклеотидов, полезной для медицинского применения, являются модификации 2'-сахаров . Модификация сахара в 2'-положении повышает эффективность олигонуклеотидов за счет усиления способности олигонуклеотидов связываться с мишенью, особенно в терапии антисмысловыми олигонуклеотидами . [8] Они также уменьшают неспецифическое связывание белков, повышая точность воздействия на конкретные белки. [8] Двумя наиболее часто используемыми модификациями являются 2'-O-метил и 2'-O-метоксиэтил. [8] Также сообщалось о флуоресцентных модификациях нуклеиновых оснований. [11]

Антисмысловые олигонуклеотиды

[ редактировать ]

Антисмысловые олигонуклеотиды (АСО) представляют собой одиночные цепи ДНК или РНК, комплементарные выбранной последовательности. [6] В случае антисмысловой РНК они предотвращают трансляцию белков определенных цепей информационной РНК , связываясь с ними в процессе, называемом гибридизацией . [12] Антисмысловые олигонуклеотиды можно использовать для нацеливания на специфическую комплементарную (кодирующую или некодирующую ) РНК. Если связывание имеет место, этот гибрид может быть разрушен ферментом РНКазой H. [12] РНКаза H представляет собой фермент, который гидролизует РНК, и при использовании в качестве антисмысловых олигонуклеотидов приводит к снижению экспрессии мРНК на 80-95%. [6]

Использование антисмысловых олигонуклеотидов морфолино для нокдауна генов у позвоночных , которое в настоящее время является стандартным методом в биологии развития и используется для изучения измененной экспрессии генов и функций генов, было впервые разработано Джанет Хисман с использованием Xenopus . [13] К одобренным FDA препаратам Морфолино относятся этеплирсен и голодирсен . Антисмысловые олигонуклеотиды также использовались для ингибирования репликации вируса гриппа в клеточных линиях. [14] [15]

Нейродегенеративные заболевания, возникающие в результате одного мутантного белка, являются хорошими мишенями для терапии антисмысловыми олигонуклеотидами из-за их способности нацеливать и модифицировать очень специфические последовательности РНК с высокой селективностью. [3] Многие генетические заболевания, включая болезнь Хантингтона , болезнь Альцгеймера , болезнь Паркинсона и боковой амиотрофический склероз (АЛС), связаны с изменениями ДНК, которые приводят к неправильным последовательностям РНК и приводят к неправильной трансляции белков, оказывающих токсическое физиологическое воздействие. [16]

Интернализация клеток

[ редактировать ]

Поглощение/интернализация клетками по-прежнему представляет собой самое большое препятствие на пути к успешной терапии олигонуклеотидами (ON). Прямому усвоению, как и большинству низкомолекулярных лекарств, препятствует полианионная основная цепь и молекулярный размер ON. Точные механизмы поглощения и внутриклеточного транспорта к месту действия до сих пор во многом неясны. Более того, небольшие различия в структуре/модификациях ON (см. выше) и различия в типах клеток приводят к огромным различиям в поглощении. Считается, что поглощение клетками происходит по разным путям после адсорбции ON на поверхности клетки. Примечательно, что исследования показывают, что большинство клеток тканевой культуры легко поглощают АСО (фосфоротиотные связи) непродуктивным образом, а это означает, что никакого антисмыслового эффекта не наблюдается. В отличие от этого конъюгация АСО с лигандами, распознаваемыми G-связанными рецепторами, приводит к повышенному продуктивному поглощению. [17] Помимо этой классификации (непродуктивный или продуктивный), интернализация клеток в основном протекает энергозависимым путем (рецептор-опосредованный эндоцитоз), но нельзя исключать энергонезависимую пассивную диффузию (гимноз). После прохождения клеточной мембраны ON-терапевтические препараты инкапсулируются в ранних эндосомах , которые транспортируются к поздним эндосомам, которые в конечном итоге сливаются с лизосомами, содержащими деградирующие ферменты при низком pH. [18] Чтобы реализовать свою терапевтическую функцию, ON должен покинуть эндосому до ее деградации. В настоящее время не существует универсального метода преодоления проблем доставки, захвата клеток и выхода из эндосом, но существует несколько подходов, адаптированных к конкретным клеткам и их рецепторам. [19]

Конъюгация ON-терапевтических средств с объектом, ответственным за распознавание/поглощение клетками, не только увеличивает поглощение (см. выше), но также, как полагают, снижает сложность поглощения клетками, поскольку тогда задействуется преимущественно один (идеально известный) механизм. [18] Это было достигнуто с помощью конъюгатов малых молекул с ON, например, несущих N-ацетилгалактозамин , который воздействует на рецепторы гепатоцитов . [20] Эти конъюгаты являются отличным примером увеличения клеточного поглощения в сочетании с адресной доставкой, поскольку соответствующие рецепторы сверхэкспрессируются на клетках-мишенях, что приводит к таргетному терапевтическому действию (сравните конъюгаты антитело-лекарственное средство, которые используют сверхэкспрессированные рецепторы на раковых клетках). [19] Еще одним широко используемым и тщательно исследованным объектом для адресной доставки и увеличения поглощения олигонуклеотидов клетками являются антитела .

Аналитические методы

[ редактировать ]

Хроматография

[ редактировать ]

Алкиламиды можно использовать в качестве хроматографических неподвижных фаз. [21] Эти фазы были исследованы для разделения олигонуклеотидов. [22] Ионно-парная обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография используется для разделения и анализа олигонуклеотидов после автоматического синтеза. [23]

Масс-спектрометрия

[ редактировать ]

Смесь 5-метоксисалициловой кислоты и спермина можно использовать в качестве матрицы для анализа олигонуклеотидов в масс-спектрометрии MALDI . [24] Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением (ESI-MS) также является мощным инструментом для определения массы олигонуклеотидов. [25]

ДНК-микрочип

[ редактировать ]

ДНК-микрочипы представляют собой полезное аналитическое применение олигонуклеотидов. По сравнению со стандартными микрочипами кДНК , микрочипы на основе олигонуклеотидов обладают более контролируемой специфичностью в отношении гибридизации и способностью измерять наличие и распространенность альтернативно сплайсированных или полиаденилированных последовательностей. [26] Один из подтипов ДНК-микрочипов можно охарактеризовать как субстраты (нейлон, стекло и т. д.), с которыми с высокой плотностью связаны олигонуклеотиды. [27] Существует ряд применений микрочипов ДНК в науках о жизни. [ нужна ссылка ]

См. также

[ редактировать ]
  • Аптамеры , олигонуклеотиды с важным биологическим применением.
  • Морфолиноиды , олигонуклеотиды с неприродным остовом, которые не активируют РНКазу-H, но могут снижать экспрессию генов или модифицировать сплайсинг РНК.
  • Полиморфизм — появление в популяции одного и того же гена в нескольких формах вследствие мутаций; часто можно проверить с помощью датчиков ASO
  • CpG-олигодезоксинуклеотид , ОДН с иммуностимулирующими свойствами.
  • Полипуриновые шпильки обратного Хугстина , PPRH, олигонуклеотиды, которые могут связывать ДНК или РНК и снижать экспрессию генов.
  1. ^ Ян Дж., Столи Дж.А., Цзян Х., Сяо Л., Кисман В.Ф., Антиа Ф.Д. и др. (октябрь 2018 г.). «Твердофазный синтез фосфоротиоатных олигонуклеотидов с использованием побочных продуктов сульфуризации для кэпирования in situ». Журнал органической химии . 83 (19): 11577–11585. дои : 10.1021/acs.joc.8b01553 . ПМИД   30179468 . S2CID   52157806 .
  2. ^ Куреши А., Тхакур Н., Монга И., Тхакур А., Кумар М. (1 января 2014 г.). «VIRmiRNA: комплексный ресурс экспериментально подтвержденных вирусных микроРНК и их мишеней» . База данных . 2014 : бау103. дои : 10.1093/база данных/bau103 . ПМК   4224276 . ПМИД   25380780 .
  3. ^ Jump up to: а б Монга И, Куреши А, Тхакур Н, Гупта А.К., Кумар М. (2017). «ASPsiRNA: ресурс ASP-siRNA, обладающий терапевтическим потенциалом в отношении генетических нарушений человека, и алгоритм прогнозирования их ингибирующей эффективности» . G3: Гены, геномы, генетика . 7 (9): 2931–2943. дои : 10.1534/g3.117.044024 . ПМК   5592921 . ПМИД   28696921 .
  4. ^ Вайс, Б., изд. (1997). Антисмысловые олигодезоксинуклеотиды и антисмысловая РНК: новые фармакологические и терапевтические средства. Бока-Ратон, Флорида: CRC Press
  5. ^ Вайс Б., Давидкова Г., Чжоу Л.В. (1999). «Генная терапия антисмысловыми РНК для изучения и модуляции биологических процессов» . Клеточные и молекулярные науки о жизни . 55 (3): 334–58. дои : 10.1007/s000180050296 . ПМЦ   11146801 . ПМИД   10228554 . S2CID   9448271 .
  6. ^ Jump up to: а б с Диас Н., Штейн, Калифорния (март 2002 г.). «Антисмысловые олигонуклеотиды: основные понятия и механизмы» . Молекулярная терапия рака . 1 (5): 347–55. ПМИД   12489851 .
  7. ^ Фрейзер К.С. (январь 2015 г.). «Терапия антисмысловыми олигонуклеотидами: перспективы и проблемы с точки зрения токсикологического патолога». Токсикологическая патология . 43 (1): 78–89. дои : 10.1177/0192623314551840 . ПМИД   25385330 . S2CID   37981276 .
  8. ^ Jump up to: а б с д ДеВос С.Л., Миллер Т.М. (июль 2013 г.). «Антисмысловые олигонуклеотиды: лечение нейродегенерации на уровне РНК» . Нейротерапия . 10 (3): 486–97. дои : 10.1007/s13311-013-0194-5 . ПМК   3701770 . ПМИД   23686823 .
  9. ^ Jump up to: а б Экстайн Ф. (апрель 2000 г.). «Фосфоротиоатолигодезоксинуклеотиды: каково их происхождение и что в них уникального?». Разработка лекарств на основе антисмысловых и нуклеиновых кислот . 10 (2): 117–21. дои : 10.1089/oli.1.2000.10.117 . ПМИД   10805163 .
  10. ^ Штейн К.А., Субасингхе С., Шинозука К., Коэн Дж.С. (апрель 1988 г.). «Физико-химические свойства фосфоротиоатолигодезоксинуклеотидов» . Исследования нуклеиновых кислот . 16 (8): 3209–21. дои : 10.1093/нар/16.8.3209 . ПМК   336489 . ПМИД   2836790 .
  11. ^ Jump up to: а б Мишель БЯ, Дзюба Д, Бенхида Р, Демченко А.П., Бургер А (2020). «Исследование структур нуклеиновых кислот, динамики и взаимодействия с экологически чувствительными флуоресцентными метками» . Границы в химии . 8 : 112. Бибкод : 2020FrCh....8..112M . дои : 10.3389/fchem.2020.00112 . ПМК   7059644 . ПМИД   32181238 .
  12. ^ Jump up to: а б Крук С.Т. (апрель 2017 г.). «Молекулярные механизмы антисмысловых олигонуклеотидов» . Нуклеиновая кислотная терапия . 27 (2): 70–77. дои : 10.1089/нат.2016.0656 . ПМЦ   5372764 . ПМИД   28080221 .
  13. ^ Хисман Дж., Кофрон М., Уайли С. (июнь 2000 г.). «Сигнальная активность бета-катенина, анализируемая у ранних эмбрионов Xenopus: новый антисмысловой подход» . Биология развития . 222 (1): 124–34. дои : 10.1006/dbio.2000.9720 . ПМИД   10885751 .
  14. ^ Кумар П., Кумар Б., Раджпут Р., Саксена Л., Банерджи А.С., Ханна М. (ноябрь 2013 г.). «Перекрестный защитный эффект антисмыслового олигонуклеотида, проявленный против обычного 3'-NCR генома вируса гриппа А». Молекулярная биотехнология . 55 (3): 203–11. дои : 10.1007/s12033-013-9670-8 . ПМИД   23729285 . S2CID   24496875 .
  15. ^ Кумар Б., Ханна М., Кумар П., Суд В., Вьяс Р., Банерджиа А.С. (май 2012 г.). «Опосредованное нуклеиновой кислотой расщепление гена M1 вируса гриппа А значительно усиливается антисмысловыми молекулами, нацеленными на гибридизацию вблизи места расщепления». Молекулярная биотехнология . 51 (1): 27–36. дои : 10.1007/s12033-011-9437-z . ПМИД   21744034 . S2CID   45686564 .
  16. ^ Смит Р.А., Миллер Т.М., Яманака К., Мония Б.П., Кондон Т.П., Хунг Г. и др. (август 2006 г.). «Антисмысловая олигонуклеотидная терапия нейродегенеративных заболеваний» . Журнал клинических исследований . 116 (8): 2290–6. дои : 10.1172/JCI25424 . ПМК   1518790 . ПМИД   16878173 .
  17. ^ Мин, Синь; Алам, штат Мэриленд Роушон; Фишер, Майкл; Ян, Юнджун; Чен, Сяоюань; Джулиано, Рудольф Л. (15 июня 2010 г.). «Внутриклеточная доставка антисмыслового олигонуклеотида посредством эндоцитоза рецептора, связанного с G-белком» . Исследования нуклеиновых кислот . 38 (19): 6567–6576. дои : 10.1093/нар/gkq534 . ISSN   1362-4962 . ПМЦ   2965246 . ПМИД   20551131 .
  18. ^ Jump up to: а б Хонер, Мануэль; Духо, Кристиан (16 декабря 2020 г.). «Клеточное нацеливание олигонуклеотидов путем конъюгации с малыми молекулами» . Молекулы . 25 (24): 5963. doi : 10,3390/molecules25245963 . ISSN   1420-3049 . ПМЦ   7766908 . ПМИД   33339365 .
  19. ^ Jump up to: а б Крук, ST (2017). «Клеточное поглощение и транспортировка антисмысловых олигонуклеотидов» . Нат. Биотехнология . 35 (3): 230–237. дои : 10.1038/nbt.3779 . ПМИД   28244996 . S2CID   1049452 .
  20. ^ Пракаш, Тажа П.; Грэм, Марк Дж.; Ю, Цзинхуа; Карти, Рик; Лоу, Одри; Чаппелл, Альфред; Шмидт, Карстен; Чжао, Чэньгуан; Агаджан, Мариам; Мюррей, Хизер Ф.; Райни, Стэн; Бутен, Шери Л.; Мюррей, Сьюзен Ф.; Гаус, Ганс; Кросби, Джефф (июль 2014 г.). «Направленная доставка антисмысловых олигонуклеотидов в гепатоциты с использованием триантеннарного N-ацетилгалактозамина улучшает эффективность у мышей в 10 раз» . Исследования нуклеиновых кислот . 42 (13): 8796–8807. дои : 10.1093/nar/gku531 . ISSN   1362-4962 . ПМК   4117763 . ПМИД   24992960 .
  21. ^ Бушевски Б., Кастури П., Гилпин Р.К., Гангода М.Е., Яронец М. (август 1994 г.). «Хроматографические и сопутствующие исследования алкиламидных фаз». Хроматография . 39 (3–4): 155–61. дои : 10.1007/BF02274494 . S2CID   97825477 .
  22. ^ Бушевски Б., Сафаи З., Студзиньска С. (январь 2015 г.). «Анализ олигонуклеотидов методом жидкостной хроматографии с неподвижной фазой алкиламида» . Открытая химия . 13 (1). doi : 10.1515/chem-2015-0141 .
  23. ^ Гилар, М.; Фонтан, Кей Джей; Будман, Ю.; Нойе, УД; Ярдли, КР; Рейнвилл, Пенсильвания; Рассел Р.Дж., 2-й; Геблер, Дж. К. (7 июня 2002 г.). «Ионно-парный обращенно-фазовый высокоэффективный жидкостный хроматографический анализ олигонуклеотидов:: Прогнозирование удерживания» . Журнал хроматографии А. 958 (1–2): 167–182. дои : 10.1016/S0021-9673(02)00306-0 . ISSN   0021-9673 . ПМИД   12134814 . {{cite journal}}: CS1 maint: числовые имена: список авторов ( ссылка )
  24. ^ Дистлер А.М., Эллисон Дж. (апрель 2001 г.). «5-Метоксисалициловая кислота и спермин: новая матрица для масс-спектрометрического анализа олигонуклеотидов с помощью матричной лазерной десорбции / ионизации». Журнал Американского общества масс-спектрометрии . 12 (4): 456–62. Бибкод : 2001JASMS..12..456D . дои : 10.1016/S1044-0305(01)00212-4 . ПМИД   11322192 . S2CID   18280663 .
  25. ^ Шах С., Фридман Ш. (март 2008 г.). «Метод ESI-MS для характеристики нативных и модифицированных олигонуклеотидов, используемых для РНК-интерференции и других биологических применений». Протоколы природы . 3 (3): 351–6. дои : 10.1038/nprot.2007.535 . ПМИД   18323805 . S2CID   2093309 .
  26. ^ Релогио А., Швагер С., Рихтер А., Ансорж В., Валькарсель Дж. (июнь 2002 г.). «Оптимизация ДНК-микрочипов на основе олигонуклеотидов» . Исследования нуклеиновых кислот . 30 (11): 51д–51. дои : 10.1093/нар/30.11.e51 . ПМЦ   117213 . ПМИД   12034852 .
  27. ^ Гонг П., Харберс ГМ, Грейнджер Д.В. (апрель 2006 г.). «Мультитехнологическое сравнение поверхностной плотности иммобилизованных и гибридизированных олигонуклеотидов на коммерческих предметных стеклах микрочипов, реагирующих на амины». Аналитическая химия . 78 (7): 2342–51. дои : 10.1021/ac051812m . ПМИД   16579618 .

Дальнейшее чтение

[ редактировать ]
  • Спинглер Б. (январь 2012 г.). «Глава 3. Конформационные изменения олигонуклеотидов, стимулируемые ионами металлов». В Sigel A, Sigel H, Sigel RK (ред.). Взаимодействие между ионами металлов и нуклеиновыми кислотами . Том. 10. Springer Science & Business Media. стр. 103–118. дои : 10.1007/978-94-007-2172-2_3 . ПМИД   22210336 . {{cite book}}: |journal= игнорируется ( помогите )
[ редактировать ]
Arc.Ask3.Ru: конец переведенного документа.
Arc.Ask3.Ru
Номер скриншота №: 7f4b7a01ee63f36d43da0a8f8152f1d0__1717996440
URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/7f/d0/7f4b7a01ee63f36d43da0a8f8152f1d0.html
Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1:
Oligonucleotide - Wikipedia
Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)