П-элемент

P- элементы — это мобильные элементы , которые были обнаружены у дрозофилы как возбудители генетических признаков, называемых гибридной дисгенезией . Транспозон отвечает за признак P элемента P и встречается только у диких мух. Они также обнаружены у многих других эукариот. ^{[ 1 ]}

Название было впервые предложено биологом-эволюционистом Маргарет Кидвелл , которая вместе с Джеймсом Кидвеллом и Джоном Сведом исследовала гибридную дисгенезию у дрозофилы. Они называли штаммы P отцовским и M материнским, если они способствовали гибридному дисгенезу в этой репродуктивной роли. ^{[ 2 ]}

Элемент P кодирует фермент, известный как P -транспозаза . Считается , что в отличие от самок, выращенных в лаборатории, самки дикого типа также экспрессируют ингибитор функции P -транспозазы, продуцируемый тем же самым элементом. Этот ингибитор уменьшает нарушения генома, вызванные перемещением P- элементов, обеспечивая фертильное потомство. Доказательства этого получены в результате скрещивания лабораторных самок (у которых отсутствует ингибитор Р- транспозазы) с самцами дикого типа (имеющими Р- элементы). В отсутствие ингибитора P- элементы могут размножаться по всему геному, разрушая многие гены и часто оказываясь смертельными для потомства или делая его стерильным.

Р- элементы обычно используются в качестве мутагенных агентов в генетических экспериментах с дрозофилой . Одним из преимуществ этого подхода является то, что мутации легко обнаружить. При гибридном дисгенезе один штамм дрозофилы спаривается с другим штаммом дрозофилы , производя гибридное потомство и вызывая хромосомные повреждения, которые, как известно, являются дисгенными. Гибридная дисгенезия требует участия обоих родителей. Например, в системе PM , где штамм P вносит вклад по отцовской линии, а штамм M вносит вклад по материнской линии, может возникнуть дисгенезия. Обратное скрещивание M отца с цитотипом и матери с цитотипом P дает нормальное потомство, поскольку оно скрещивается по P x P или M x M. принципу Мужские хромосомы P могут вызвать дисгенезию при скрещивании с хромосомами M. женскими

Характеристики

Элемент P класса II представляет собой транспозон и перемещается по основанному на ДНК механизму «вырезать и вставить». Последовательность узнавания состоит из четырех экзонов , разделенных тремя интронами . ^{[ 3 ]} Полный сплайсинг интронов дает фермент транспозазу, тогда как альтернативный частичный сплайсинг интронов 1 и 2, оставляющий в транскрипте мРНК только интрон 3, кодирует P- элемента репрессор . Полный автономный элемент P кодирует фермент транспозазу, который распознает длиной 31 п.о. концевые инвертированные повторы на обоих концах элемента P и катализирует P. удаление и повторную вставку элемента Полный элемент имеет длину 2907 п.н.; неавтономные P- элементы содержат внутреннюю делецию различной длины, которая устраняет выработку транспозазы, но такие элементы все еще могут быть мобилизованы, если функциональная транспозаза кодируется где-то в геноме. Вставка P- элемента и последующее вырезание обязательно оставляют после себя прямые повторы длиной 8 п.н. в месте вырезания; таким образом, наличие таких повторов указывает на предыдущую активность P- элемента.

Все P- элементы имеют каноническую структуру, содержащую концевые инвертированные повторы длиной 31 п.н. и внутренние инвертированные повторы длиной 11 п.н., расположенные в домене THAP транспозазы. Самый короткий и самый длинный P- элементы являются неавтономными элементами. Самые длинные P- элементы кодируют транспозазу, необходимую для транспозиции. Та же самая последовательность, которая кодирует транспозазу, также кодирует супрессор транспозиции, который накапливается в цитоплазме во время развития клеток. Таким образом, при скрещивании самца Р или М с самкой Р цитоплазма самки содержит супрессор, который связывается с любыми Р- элементами и предотвращает их транспозицию.

Гибридная дисгенезия

Гибридный дисгенез означает высокую частоту мутаций в зародышевой линии клетках штаммов дрозофилы , возникающую в результате скрещивания самцов с автономными P- элементами ( штамм P / цитотип P ) и самок, у которых отсутствуют элементы P ( штамм M / цитотип M ). Синдром гибридного дисгенеза характеризуется температурно-зависимой стерильностью, повышенным уровнем мутаций и усилением хромосомных перестроек и рекомбинаций.

На фенотип гибридного дисгенеза влияет транспозиция P- элементов в клетках зародышевой линии потомков самцов штамма P и M. самок штамма Транспозиция происходит только в клетках зародышевой линии, поскольку событие сплайсинга, необходимое для образования транспозазы, мРНК не происходит в соматических клетках.

Гибридная дисгенезия проявляется при скрещивании самцов линии Р с самками линии М , а не при скрещивании самок линии Р (самок с автономными Р- элементами) с М. самцами линии Яйца самок штамма P содержат большое количество белка- репрессора , который предотвращает транскрипцию гена транспозазы. Яйцеклетки материнского штамма М , не содержащие белка-репрессора, позволяют осуществлять транспозицию Р- элементов из спермы отцов. У самок штамма P репрессоры обнаруживаются в цитоплазме. Следовательно, когда самцы штамма P оплодотворяют самок штамма M (цитоплазма которых не содержит репрессора), самец вносит в свой геном элемент P , но не мужскую цитоплазму, что приводит к P. потомству штамма ^{[ 3 ]}

Этот эффект способствует тому, что piRNA наследуются только по материнской линии, что обеспечивает механизм защиты от P- элементов. ^{[ 4 ]}

Использование в молекулярной биологии

Элемент P нашел широкое применение в исследованиях дрозофилы в качестве мутагена. В системе мутагенеза обычно используется автономный, но неподвижный элемент и мобильный неавтономный элемент. Затем мух последующих поколений можно проверить фенотипом или ПЦР . Встречающиеся в природе P- элементы содержат кодирующую последовательность фермента транспозазы и последовательности распознавания действия транспозазы. Транспозаза регулирует и катализирует удаление элемента P из ДНК хозяина, разрезая два сайта узнавания, а затем случайным образом повторно вставляя его. Это случайная вставка, которая может мешать существующим генам или нести дополнительный ген, который можно использовать для генетических исследований.

Чтобы использовать это как полезный и контролируемый генетический инструмент, две части элемента P должны быть разделены, чтобы предотвратить неконтролируемую транспозицию. Обычными генетическими инструментами являются ДНК, кодирующая транспозазу, без последовательностей распознавания транспозазы, поэтому она не может вставляться, и « P- плазмида». P -плазмиды всегда содержат репортерный ген дрозофилы , часто маркер красных глаз (продукт белого гена), и последовательности распознавания транспозазы. Они могут содержать интересующий ген, ген E. coli селектируемый маркерный , часто какой-либо тип устойчивости к антибиотикам , точку начала репликации или другие связанные плазмидные «домашние» последовательности.

Способы использования

Существует два основных способа использования этих инструментов:

Летающая трансформация

Клонируйте элемент P в плазмиду, трансформируйте и выращивайте ее в бактериях.
Устраните P -транспозазу и замените ее интересующим вас геном.
Микроинъецируйте на ранней стадии (прецеллюляризации) задний конец эмбриона ДНК, кодирующей транспозазу, и плазмиду с репортерным геном, представляющим интерес геном и последовательностями распознавания транспозазы.
Происходит случайная транспозиция, включающая интересующий ген и репортерный ген.
После того, как интересующий ген был вставлен, он больше не является мобильным, поскольку не может производить собственную Р- транспозазу.
Выращивайте мух и скрещивайте их, чтобы устранить генетические различия между клетками организма. (Только некоторые клетки организма будут трансформированы. Будем надеяться, что некоторые из этих трансформированных клеток окажутся в зародышевой линии. Трансформированная гамета даст начало организму без каких-либо различий между его клетками).
Ищите мух, экспрессирующих репортерный ген. Они несут встроенный интересующий ген, поэтому их можно исследовать для определения фенотипа интересующего гена.

Вставленный ген мог повредить функцию одного из генов хозяина. Требуется несколько линий мух, чтобы можно было провести сравнение и убедиться, что никакие дополнительные гены не были выбиты.

Инсерционный мутагенез

Микроинъецируйте в эмбрион ДНК, кодирующую транспозазу, и плазмиду с репортерным геном и последовательностями распознавания транспозазы (а часто и репортерный ген E. coli , точку начала репликации и т. д.).
Происходит случайная транспозиция, при которой репортерный ген вставляется случайным образом. Вставка имеет тенденцию происходить вблизи активно транскрибируемых генов, поскольку именно здесь структура хроматина наиболее рыхлая, поэтому ДНК наиболее доступна.
Выращивайте мух и скрещивайте их, чтобы устранить генетические различия между клетками организма (см. выше).
Ищите мух, экспрессирующих репортерный ген. Они прошли успешную транспозицию, поэтому их можно исследовать для определения фенотипа из-за мутации существующих генов.

Возможные мутации:

Вставка в транслируемую область => гибридный белок/усеченный белок. Обычно вызывает потерю функции белка, хотя наблюдаются и более сложные эффекты.
Вставка в интрон => измененный паттерн сплайсинга /ошибка сплайсинга. Обычно это приводит к усечению белка или образованию неактивных продуктов неправильного сплайсинга, хотя распространены и более сложные эффекты.
Вставка в 5'-нетранслируемую область (последовательность, которая станет 5'-UTR мРНК) => усечение транскрипта. Обычно это приводит к тому, что мРНК не содержит 5'-кэпа , что приводит к менее эффективной трансляции.
Вставка в промотор => снижение/полная потеря экспрессии. Всегда приводит к значительному снижению уровня производства белка. Самый полезный тип вставки для анализа из-за простоты ситуации.
Вставка между промотором и вышестоящими энхансерами => потеря функции энхансера/нарушение функции энхансера репортерного гена.† Обычно снижает уровень специфичности белка к типу клеток, хотя часто наблюдаются сложные эффекты.

Перехват энхансера

Захват энхансера другого гена позволяет проанализировать функцию этого энхансера. Это, особенно если репортерный ген предназначен для флуоресцентного белка, может быть использовано для картирования экспрессии мутировавшего гена в организме и является очень мощным инструментом. Это полезный инструмент для изучения закономерностей экспрессии генов (временных и пространственных).

Другое использование

Эти методы называются обратной генетикой. Обратная генетика — это подход к обнаружению функции гена путем анализа фенотипических эффектов определенных последовательностей генов, полученных путем секвенирования ДНК.

Анализ продуктов мутагенеза

После определения функции мутированного белка можно секвенировать/очистить/клонировать области, фланкирующие вставку, следующими методами:

Обратная ПЦР

Изолировать геном мухи.
Провести легкий перевар (с использованием фермента [фермента 1], который, как известно, НЕ разрезает репортерный ген), получив фрагменты в несколько тысяч оснований, некоторые со вставкой и фланкирующей ДНК.
Самолигируйте гидролизат (низкая концентрация ДНК для обеспечения самолигирования), получая выборку кольцевых фрагментов ДНК, некоторые из которых содержат вставку и фланкирующую ее ДНК.
Разрежьте плазмиды в какой-то точке репортерного гена (с помощью фермента [фермент 2], который, как известно, очень редко разрезает геномную ДНК, но известен в репортерном гене).
Используя праймеры для участков репортерного гена, ДНК можно амплифицировать для секвенирования .

Процесс разрезания, самолигирования и повторного разрезания позволяет амплифицировать фланкирующие области ДНК без знания последовательности. Точку, в которой произошло лигирование, можно увидеть, определив место разреза [фермента 1].

Спасение плазмиды

Изолировать геном мухи.
Провести легкий перевар (с использованием фермента [фермента 1], который, как известно, разрезает границу между репортерным геном и репортерным геном E. coli и последовательностями плазмиды), давая фрагменты в несколько тысяч оснований, некоторые с репортером E. coli , плазмидные последовательности и фланкирующая их ДНК.
Самолигируйте гидролизат (низкая концентрация ДНК для обеспечения самолигирования), получая выборку кольцевых фрагментов ДНК, некоторые из которых содержат репортер E. coli , плазмидные последовательности и фланкирующую их ДНК.
Вставьте плазмиды в клетки E. coli (например, электропорацией).
Выберите плазмиды для E. coli гена селектируемого маркера . Только успешные вставки плазмид с последовательностями «домашнего хозяйства» плазмиды будут экспрессировать этот ген.
Ген можно клонировать для дальнейшего анализа.

Литература

Леланд Хартвелл и др.. 2004. Генетика – от генов к геномам, 2-е изд. МакГроу-Хилл
Энгельс, В.Р. Элементы П у дрозофилы.

Ссылки

^ Маджумдар, С; Рио, округ Колумбия (апрель 2015 г.). «P Мобильные элементы у дрозофилы и других эукариотических организмов» . Микробиологический спектр . 3 (2): MDNA3–0004–2014. doi : 10.1128/microbiolspec.MDNA3-0004-2014 . ПМК 4399808 . ПМИД 26104714 .
^ Кидвелл, Маргарет Дж; Кидвелл, Джеймс Ф; Свед, Джон А. (1 августа 1977 г.). «ГИБРИДНЫЙ ДИСГЕНЕЗ У DROSOPHILA MELANOGASTER : СИНДРОМ АБЕРРАНТНЫХ ПРИЗНАКОВ, ВКЛЮЧАЯ МУТАЦИЮ, СТЕРИЛЬНОСТЬ И МУЖСКУЮ РЕКОМБИНАЦИЮ» . Генетика . 86 (4): 813–833. дои : 10.1093/генетика/86.4.813 . ISSN 1943-2631 . ПМЦ 1213713 . ПМИД 17248751 .
^ Jump up to: ^а ^б Гриффитс, Эй Джей (2005). Введение в генетический анализ . Макмиллан.
^ Бреннеке, Дж.; и др. (2008). «Эпигенетическая роль унаследованных по материнской линии piRNA в подавлении транспозонов» . Наука . 322 (5906): 1387–1392. Бибкод : 2008Sci...322.1387B . дои : 10.1126/science.1165171 . ПМК 2805124 . ПМИД 19039138 .

Внешние ссылки

FlyBase

[pmdid26104714-1] Маджумдар, С; Рио, округ Колумбия (апрель 2015 г.). «P Мобильные элементы у дрозофилы и других эукариотических организмов» . Микробиологический спектр . 3 (2): MDNA3–0004–2014. doi : 10.1128/microbiolspec.MDNA3-0004-2014 . ПМК 4399808 . ПМИД 26104714 .

[2] Кидвелл, Маргарет Дж; Кидвелл, Джеймс Ф; Свед, Джон А. (1 августа 1977 г.). «ГИБРИДНЫЙ ДИСГЕНЕЗ У DROSOPHILA MELANOGASTER : СИНДРОМ АБЕРРАНТНЫХ ПРИЗНАКОВ, ВКЛЮЧАЯ МУТАЦИЮ, СТЕРИЛЬНОСТЬ И МУЖСКУЮ РЕКОМБИНАЦИЮ» . Генетика . 86 (4): 813–833. дои : 10.1093/генетика/86.4.813 . ISSN 1943-2631 . ПМЦ 1213713 . ПМИД 17248751 .

[Griffiths_2005-3] Jump up to: ^а ^б Гриффитс, Эй Джей (2005). Введение в генетический анализ . Макмиллан.

[Brennecke-4] Бреннеке, Дж.; и др. (2008). «Эпигенетическая роль унаследованных по материнской линии piRNA в подавлении транспозонов» . Наука . 322 (5906): 1387–1392. Бибкод : 2008Sci...322.1387B . дои : 10.1126/science.1165171 . ПМК 2805124 . ПМИД 19039138 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]