Гелитрон (биология)

Гелитроны — одна из трех описанных к настоящему времени групп эукариотических 2-го класса мобильных элементов (TE) . Это эукариотические мобильные элементы по типу катящегося круга, которые, как предполагается, перемещаются по механизму репликации по катящемуся кругу через промежуточную одноцепочечную ДНК . Впервые они были обнаружены у растений ( Arabidopsis thaliana и Oryza sativa ) и у нематоды Caenorhabditis elegans , а теперь они идентифицированы у самых разных видов, от простейших до млекопитающих . Гелитроны составляют значительную часть многих геномов , где число неавтономных элементов часто превышает численность предполагаемого автономного партнера. Гелитроны, по-видимому, играют важную роль в эволюции геномов хозяев. Они часто захватывают разнообразные гены хозяина, некоторые из которых могут эволюционировать в новые гены хозяина или стать необходимыми для транспозиции Helitron .

История

Гелитроны были первой группой TE, обнаруженной с помощью компьютерного анализа последовательностей всего генома. Первые описанные гелитроны назывались Aie, AthE1, Atrep и Basho, которые являются неавтономными гелитронами, обнаруженными в геноме Arabidopsis thaliana . небольшого цветкового растения Несмотря на эти открытия, классификация гелитронов была неизвестна до 2001 года, когда были открыты кодирующие белки элементы, которые, как предполагалось, были автономными партнерами. Капитонов и Юрка исследовали кодирующую способность гелитронов у A. thaliana , Oryza sativa и Caenorhabditis elegans , используя in silico исследования повторяющейся ДНК этих организмов, компьютерный анализ и моделирование Монте-Карло . Они описали структуру и кодирующий потенциал канонических гелитронов и предположили механизм транспозиции по принципу катящегося круга, а также возможность того, что некоторые из закодированных генов, захваченных у хозяина, теперь используются для репликации. Их исследование генома этих организмов показало, что активность Helitron могла составлять значительную часть (~ 2%) геномов растений и беспозвоночных, где они были обнаружены, но степень их распространения в других местах не была ясна.

В 2003 году группа исследователей изучила структуру белков, связанных с гелитронами, и различных кодирующих доменов внутри них, ища гелитрон-подобные элементы у позвоночных, в частности, у рыбы-зебры Danio rerio и рыбы-фугу Sphoeroides nephelus . Было предсказано, что белки Rep/Helicase будут на 500–700 аминокислот длиннее из-за С-концевого слияния домена, гомологичного апуриново-апиримидиновой (AP) эндонуклеазе. Предыдущие филогенетические исследования показали, что эндонуклеаза AP вложена в кладу ретротранспозонов куриного повтора 1 (CR1) с недлинными концевыми повторами (non-LTR). Эта связь предполагает, что эндонуклеаза AP возникла в результате вставки ретротранспозона либо рядом, либо внутри гелитрона. Эти исследователи не смогли идентифицировать концы Rep/Helicase/Endonuclease единицы гелитронов.

В последние годы гелитроны были идентифицированы во всех царствах эукариот, но число их геномных копий сильно варьируется даже среди близкородственных видов. Они составляют 1–5% геномной ДНК у различных плодовых мушек, 0–3% у млекопитающих, >0,5% у лягушки. У большинства млекопитающих присутствие гелитрона незначительно и ограничивается остатками старых транспозонов, за исключением геномов летучих мышей, которые населены многочисленными молодыми элементами. Однако спустя много лет после описания автономных гелитронов не было опубликовано никаких механистических исследований, и поэтому механизм транспозиции по принципу катящегося круга остается хорошо подтвержденной, но еще не проверенной гипотезой.

Структура

Структура и кодирующая способность канонических гелитронов животных и растений

Гелитроны структурно асимметричны и являются единственным классом транспозонов эукариотической ДНК, которые не генерируют дублирования сайтов-мишеней во время транспозиции. Канонические гелитроны обычно начинаются с 5'-T (C/T) и заканчиваются нуклеотидами CTRR (чаще всего CTAG, но иногда отмечаются вариации), но не содержат терминальных инвертированных повторов. Кроме того, они часто имеют короткую шпильку палиндромной последовательности (от 16 до 20 нуклеотидов) примерно в 11 п.о. от 3'-конца. Они интегрируются между динуклеотидами хозяина AT. Некоторые семейства гелитронов также несут тандемные повторы, такие как микросателлиты и минисателлиты, которые обычно представляют собой сильно мутабельные последовательности.

Большинство гелитронов не являются автономными элементами и имеют общие концы и другие структурные признаки с автономными гелитронами, но они не кодируют какой-либо полный набор белков, кодируемых автономными элементами. Основными ферментативными признаками гелитронов являются домены инициатора репликации по катящемуся кругу (RC) (Rep) и ДНК-хеликазы (Hel), которые присутствуют в белке, содержащем 1000–3000 аминокислот (аа) (Rep/Hel), кодируемых всеми автономные элементы Гелитрона. Белок Rep/Helicase включает мотивы цинковых пальцев, домен Rep (который представляет собой ~100 аминокислот и обладает эндонуклеазной активностью HUH) и восьмидоменную хеликазу семейства PiF1 (SuperFamily1), которые универсально консервативны в Helitrons. Мотивы, напоминающие цинковые пальцы, связаны со связыванием ДНК. Домен Hel ~400 аминокислот классифицируется как Hel от 5' до 3' ДНК, который участвует в разрыве и соединении одноцепочечной ДНК и характеризуется как наличием мотива HUH (два остатка гистидина, разделенных гидрофобной остаток) и мотив Y (один или два остатка тирозина , разделенные несколькими аминокислотами). Семейство хеликаз PiF1 (Hel) обладает активностью раскручивания от 5' до 3', которая для многих объектов типа катящегося круга эта активность кодируется хозяином. Растительные гелитроны также кодируют открытую рамку считывания, гомологичную одноцепочечным ДНК-связывающим белкам (RPA). Обычно белки RPA в гелитронах имеют длину 150–500 аминокислот и кодируются несколькими экзонами. Во всех Helitrons домен Rep предшествует домену Hel.

Трехмерная структура транспозазы Helitron, ковалентно связанной с левым концом транспозона, была недавно определена методом криоЭМ.

Механизмы транспозиции катящегося круга

Предполагается, что гелитроны транспонируются по механизму, аналогичному репликации по вращающемуся кругу, через промежуточное соединение одноцепочечной ДНК. Предложены две модели механизма транспозиции: согласованная и секвенциальная. В согласованной модели расщепление и лигирование донорской цепи происходят одновременно, тогда как в последовательной модели они происходят ступенчато. Согласованная модель не требует циклического промежуточного звена, хотя оно может возникнуть, если какой-то шаг не удался или был пропущен во время транспозиции. Последовательная модель отличается тем, что круговой промежуточный продукт является необходимым шагом транспозиции, и поскольку до недавнего времени круговые промежуточные соединения не были известны для гелитронов, согласованная модель была адаптирована для объяснения транспозиции.

В любом случае, используя восстановленные транспозоны Helraiser для изучения транспозиции Helitron, было показано, что донорский сайт должен быть двухцепочечным и что одноцепочечных доноров будет недостаточно.

Согласованная модель

Механизм катящегося круга для транспозиции гелитрона и приобретения генов в согласованной модели

Гелитрон мог быть как автономным, так и неавтономным. Одна молекула транспозазы расщепляет донорный (по первому остатку тирозина (Y1) белка Rep) и целевой сайты (по второму остатку тирозина (Y2)) и связывается с образовавшимися 5'-концами. Свободный 3'-ОН в целевой ДНК атакует связь ДНК-Y1 и образует связь с донорной цепью, что приводит к переносу цепи. Репликация в расщепленном донорном сайте инициируется со свободного 3'-ОН, где донорская цепь служит праймером для синтеза ДНК ДНК-полимеразой хозяина, и репликация продолжается с вытеснением одной цепи гелитрона. Если палиндром и 3'-конец элемента распознаны правильно, расщепление происходит после последовательности CTRR, и одна цепь Helitron переносится в донорный сайт, где репликация ДНК разрешает гетеродуплекс.

Последовательная модель

а) Плазмида, содержащая гелитрон: ген устойчивости к антибиотику (канамицин) вставлен между левой и правой концевыми последовательностями (LTS и RTS соответственно); б) Круговой интермедиат транспозиции: концевые последовательности соединены вместе (серая стрелка указывает на промотор гена)

В 2016 году было опубликовано одно из первых механистических исследований транспозиции гелитрона, призванное пролить свет на различные этапы транспозиции. На основе консенсусной последовательности он реконструировал вероятного предка семейства гелитронов Helibat, присутствующего в геноме маленькой коричневой летучей мыши ( Myotis Lucifugus ), единственной группы млекопитающих, обладающей важным количеством гелитронов в своем геноме . Этот активный транспозон был встроен в плазмиду, действующую как донор гелитрона. Ген устойчивости к антибиотику был включен между двумя концевыми последовательностями гелитрона, чтобы обеспечить изоляцию клеток, в которых произошла транспозиция.

При транспозиции гелитрона образуется кольцевой интермедиат, который был выделен в клетках, трансфицированных плазмидой. Он образуется путем соединения концевых концов и предполагает модель транспозиции по типу катящегося кольца, во время которой расщепление как донорной, так и целевой цепи не происходит одновременно, поскольку одноцепочечная кольцевая ДНК сначала образуется с помощью одного нитей гелитрона.

Эта модель подтверждается тем фактом, что удаление одного из двух тирозинов (Y727) домена Rep, который, как полагают, участвует в расщеплении цепей. на самом деле не влияет на эффективность транспозиции гелитрона. Потребуется только один из тирозинов, для того, чтобы обеспечить двухэтапный процесс: 1) расщепление донорской ДНК и 2) интеграцию в целевой сайт.

Донорская последовательность (черная) и целевая последовательность (синяя); гелитрон разделен на три части (LTS — синий, кодирующая последовательность — серый и RTS — фиолетовый). а) тирозин белка Rep-Hel расщепляет 5'-конец LTS донорской последовательности; б) используя активность геликазы от 5' к 3', Rep-Hel перемещается к 3'-концу RTS; в) расщепление 3'-конца после обнаружения RTS; г) соединение концевых последовательностей и образование промежуточного круга; д) расщепление целевой цепи и интеграция гелитрона после пассивного разрешения

Механизмы захвата генов

Наличие смежных экзонов и интронов в ДНК хозяина, переносимых гелитронами, предполагает механизм приобретения, основанный на ДНК. Было предложено, чтобы захват гена Helitron происходил поэтапно или последовательно, т.е. захват гена происходит во время одной транспозиции, а захват второго гена происходит во время последующего события транспозиции. Поэтапный захват приведет к появлению гелитронов, содержащих фрагменты генов из разных мест. Модель последовательного захвата может объяснить гелитроны, несущие несколько фрагментов генов, наблюдаемые у других организмов. Для объяснения механизма захвата генов на уровне ДНК у гелитронов предложены три основные модели.

Конечная модель байпаса

Также известна как модель 1 «трансдукции» или «сквозного чтения» (RTM1). Транспозиция инициируется на 5'-конце, и происходит захват гена, если сигнал терминации 3' пропущен. Загадочный палиндром ниже по течению может стать новым терминатором, если обычный терминатор будет обойден и вся промежуточная последовательность будет захвачена. В этом отношении гелитроны можно рассматривать как машины для перетасовки экзонов. Поскольку случайная последовательность обеспечивает новый сигнал терминации, эта модель не требует высокой плотности гелитронов в геноме.

Действительно, в слияниях одноконцевого типа вставленный фрагмент донорской ДНК фланкирован на одном конце (постоянный конец) IRR, а на другом конце - последовательностью CTTG или GTTC, присутствующей в доноре (вариабельный конец) таким образом, что это обычно приводит к множественным тандемным вставкам донорской плазмиды или захвату фланкирующей последовательности в целевом сайте. Эта неспособность распознать сигнал терминации транспозиции гелитрона может привести к тому, что ДНК, фланкирующая 3'-конец гелитрона, также будет перенесена вместе с гелитроном в донорский сайт (захват гена). Возможно, именно так гелитроны приобрели дополнительные кодирующие последовательности. Несмотря на эту гипотезу, необходимы дальнейшие эксперименты для проверки механизма транспозиции.

Химерная модель транспозиции

Также известна как модель 2 со сквозным чтением (RTM2). В этой модели транспозиция начинается на 5'-конце гелитрона, и если 3'-конец этого гелитрона отсутствует и транспозиция завершается на следующем 3'-конце гелитрона в правильной ориентации, произойдет захват гена. В результате вся промежуточная последовательность фиксируется.

Модель ДНК-филлера (FDNA)

В этой модели части генов или некодирующие области могут случайно служить матрицами во время репарации двухцепочечных разрывов (DSB), возникающих в гелитронах во время их транспозиции. Низкоточная репарация DSB путем негомологичного соединения концов чаще встречается у растений и млекопитающих, чем репарация посредством гомологичной рекомбинации, и часто сопровождается вставками «ДНК-наполнителя» длиной 100–4000 п.о., скопированных из различных геномных или внехромосомных ДНК. регионы в DSB. Эта модель предсказывает, что области микрогомологии длиной от 2 до 8 пар оснований существуют между областями, которые фланкируют DSB в Helitron и которые фланкируют исходную последовательность хозяина, захваченную Helitron.

Другие

Для гелитронов предложены и другие модели механизма захвата генов: модель сайт-специфической рекомбинации, основанная на общих чертах гелитронов и интегранов ; Захват мобильных элементов, основанный на интеграции TE посредством транспозиции в другие TE, также называемый вложением TE. Несмотря на все эти предложенные модели, недостаточно примеров, позволяющих ограничить механизм захвата генов одной моделью. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять молекулярный механизм захвата генов и то, как он способствует выживанию гелитронов.

Доказательства, подтверждающие модели «сквозного чтения», по-видимому, заключаются в относительной недостаточности важности 3' RTS по сравнению с 5' LTS: удаление LTS приводит к серьезному снижению эффективности транспозиции гелитронов, тогда как полное удаление RTS по-прежнему приводит к значительной транспозиции, несмотря на уменьшенное количество копий. RTS указывает белку Rep-Hel на конец гелитрона и, следовательно, на конец транспозиции. Вся эта информация заключена в шпилечной структуре, образованной палиндромной последовательностью ДНК на 3'-конце. Такая небольшая структура, вероятно, со временем будет модифицироваться, что позволит обойти конец гелитрона во время его транспозиции и захватить последовательность соседних генов.

Влияние на экспрессию генов

Гелитроны, как и все другие ТЕ, являются потенциальными инсерционными мутагенами . Они могут быть вставлены в промоторную область гена, что приведет к уничтожению измеримых транскриптов и наблюдаемых фенотипов . В некоторых случаях было замечено, что вставка Helitron обеспечивает регуляторные мотивы, необходимые для инициации транскрипции. Исследователи представили доказательства того, что гелитроны внесли вклад в предполагаемые промоторы, экзоны, сайты сплайсинга, сайты полиаденилирования и сайты связывания микроРНК в транскрипты, которые в противном случае сохранялись бы у млекопитающих. Гелитроны управляют экспрессией и обеспечивают регуляторные элементы de novo, такие как CAAT-бокс, GCbox, октамерный мотив и TATA-бокса сайты . Гелитроны также могут изменять длину и последовательность как 5'-UTR, так и 3'-UTR кодирующих транскриптов. Другой способ, с помощью которого гелитроны могут контролировать экспрессию генов, заключается в создании новых вариантов сплайсинга путем стимулирования альтернативного сплайсинга и предоставления загадочных сайтов сплайсинга. Сообщалось о ряде спонтанных мутаций у растений, вызванных интронными вставками Helitron, которые приводят к образованию химерных видов транскриптов.

Полногеномная идентификация

Конвейер для полногеномной идентификации кандидатов в гелитроны и их проверки

Атипичная структура, отсутствие модификации сайта-мишени и гетерогенность последовательностей гелитронов затрудняют автоматическую идентификацию гелитронов. Для полногеномного анализа применяются два подхода для поиска канонических гелитронов: подходы к идентификации повторов de novo, которые можно использовать для создания консенсусных библиотек всех повторяющихся последовательностей, однако подходы к поиску повторов de novo позволяют идентифицировать только те гелитроны, которые присутствуют в геноме. несколько относительно однородных копий в геноме. Следовательно, малокопийные и старые Гелитроны будут иметь тенденцию быть фрагментированными и иметь плохо выраженные концы. Эти подходы ограничены качеством сборки генома и однородностью повторов. Другой подход — структурный, основанный на структурных особенностях канонических гелитронов и использующий такие программы, как Helitronfinder, HelSearch, Helraizer и HelitronScanner. Поскольку эти программы обучены на известных элементах Helitron, они могут быть неэффективны при выявлении расходящихся семейств и генерируют множество ложных срабатываний. Этот подход не создает консенсусные последовательности кандидатов в гелитроны, что приводит к образованию больших наборов данных.

Чувствительность структурного подхода (правильно идентифицировано/(правильно идентифицировано + ложноотрицательные результаты)) составляет 93%, а специфичность (правильно идентифицировано/(правильно идентифицировано + ложноположительные результаты)) составляет 99%. Есть несколько причин, по которым все другие методы открытия гелитронов были менее чувствительными и/или более подвержены ошибкам: Поиск на основе белка Rep/хеликазы дает большое количество ложноотрицательных результатов, поскольку большинство гелитронов являются неавтономными элементами. Поиск на основе сходства не выявляет новых семейств и, следовательно, будет плохо работать в недавно изученных геномах. Поиск на основе повторов требует обширной ручной обработки для идентификации семейств Helitron, что является непосильной задачей в больших геномах со значительным повторением ДНК. На основе общей чувствительности и специфичности структурный подход к идентификации элементов Helitron весьма успешен и особенно полезен для идентификации элементов Helitron в недавно охарактеризованном геноме. Однако, поскольку для выравнивания необходимо как минимум 2 копии, одиночные копии гелитронов будут пропущены.

Вертикальное наследование и горизонтальный перенос

Наследование: полногеномный анализ показал, что большая часть гелитронов, как правило, возникла совсем недавно. Молодой возраст семей Helitron, конечно, зависит от тщательно изученных геномов, в основном принадлежащих растениям и насекомым, где неограниченный период полураспада ДНК (среднее время, в течение которого теряется половина ДНК, не сохранившаяся для функции) довольно быстро. Сообщается, что в отличие от других ДНК-транспозонов гелитроны некоторых видов проявляют долговременную активность, вероятно, из-за механизма транспозиции или неспособности хозяина распознавать гелитроны из-за гетерогенности последовательности или захвата гена хозяина. В отличие от относительно более быстрого неограниченного периода полураспада ДНК (2,5–14 млн лет) в геномах растений и насекомых, период полураспада ДНК млекопитающих, по оценкам, намного медленнее (884 млн лет), что наряду с минимальными требованиями транспозиции Helitron и медленная скорость разложения млекопитающих вызвала такую ​​модель вертикального существования.

Горизонтальный перенос. Влияние горизонтального переноса (ГТ) мобильных элементов может быть значительным из-за их мутагенного потенциала, присущей им подвижности и распространенности. Исследователи нашли доказательства повторяющегося HT четырех разных семейств гелитронов у беспрецедентного множества организмов, включая млекопитающих, рептилий, рыб, беспозвоночных и вирусов насекомых. Гелитроны, присутствующие у этих видов, имеют неоднородное распределение и тесно связаны (идентичность последовательностей на 80–98%), несмотря на глубокие времена расхождения между хозяевами. В отличие от генов, гелитроны, горизонтально перенесенные в геномы новых хозяев, могут амплифицироваться, в некоторых случаях достигая нескольких сотен копий и представляя значительную часть генома. Поскольку известно, что гелитроны часто захватывают и амплифицируют фрагменты генов, HT этой уникальной группы ДНК-транспозонов может привести к горизонтальному переносу генов и вызвать драматические сдвиги в траектории эволюции генома.

Эволюционное значение

Два разных сценария описывают наиболее вероятную судьбу гена-хозяина, захваченного гелитронами: 1. Захваченный ген будет уничтожен в результате множественных мутаций, если он не обеспечит какого-либо селективного преимущества транспозонам. 2. Он будет сохранен как ген, родственный исходному гену хозяина, если его захват будет полезен для транспозона, который толерантен хозяину. Гелитроны, как и большинство других мобильных элементов в геномах A. thaliana и C. elegans, присутствуют в геномах множества сильно дивергентных семейств. Учитывая молодой возраст этих семей и степень консервативности белков, весьма маловероятно, что наблюдаемое расхождение является результатом мутаций, накопленных транспозонами, интегрированными в геном хозяина, что доказывает, что гелитроны работают как мощный инструмент эволюции. Они рекрутировали гены-хозяева, модифицировали их до степени, недостижимой с помощью менделевского процесса, и умножали их в геномах хозяина.

Будущее

Хотя общепризнано, что гелитроны являются транспозонами RC, и благодаря многочисленным исследованиям роль транспозиции гелитрона в дупликации генов и формировании генетической архитектуры была доказана, но ни различные механизмы, с помощью которых это происходит, ни частота не совсем понятны. На данный момент даже неясно, инициирует или завершает 3'-конец транспозона Helitron репликативную транспозицию Helitron. Важным шагом на пути к исследованию этого механизма могло бы стать выделение автономных гелитронов, активных in vitro и in vivo . Это можно сделать путем компьютерной идентификации полных молодых гелитронов. В ближайшем будущем подробные компьютерные исследования последовательности позволят исследователям понять историю эволюции гелитронов, а также их механизм захвата генов и их общее значение для эволюции генов.