✖


Jump to content

Репликация по катящемуся кругу

Репликация по вращающемуся кругу создает несколько копий одного круглого шаблона.

по катящемуся кругу ( RCR ) – это процесс однонаправленной репликации нуклеиновой кислоты , который может быстро синтезировать множество копий кольцевых молекул ДНК или РНК , таких как плазмиды , геномы бактериофагов Репликация и кольцевой РНК геном вироидов . Некоторые эукариотические вирусы также реплицируют свою ДНК или РНК по механизму катящегося круга.

В качестве упрощенной версии естественной репликации по катящемуся кругу был разработан метод изотермической амплификации ДНК — амплификация по катящемуся кругу. Механизм RCA широко используется в молекулярной биологии и биомедицинских нанотехнологиях , особенно в области биосенсорства (как метод усиления сигнала). [1]

Круговая репликация ДНК

[ редактировать ]
Иллюстрация репликации по катящемуся кругу.

по катящемуся кругу Репликация ДНК инициируется белком-инициатором, кодируемым ДНК плазмиды или бактериофага, который разрывает одну цепь двухцепочечной кольцевой молекулы ДНК в месте, называемом двухцепочечным началом или DSO. Белок-инициатор остается связанным с 5'-фосфатным концом разорванной цепи, а свободный 3'-гидроксильный конец высвобождается и служит праймером для синтеза ДНК ДНК-полимеразой III . Используя неповрежденную цепь в качестве матрицы, репликация происходит вокруг кольцевой молекулы ДНК, замещая разорванную цепь одноцепочечной ДНК. Замещение разорванной цепи осуществляется с помощью геликазы, кодируемой хозяином, называемой PcrA (аббревиатура, обозначающая уменьшенную копию плазмиды) в присутствии белка инициации репликации плазмиды.

Продолжение синтеза ДНК может привести к образованию множества одноцепочечных линейных копий исходной ДНК в непрерывной серии от головы к хвосту, называемой конкатемером . Эти линейные копии могут быть преобразованы в двухцепочечные кольцевые молекулы с помощью следующего процесса:

Сначала белок-инициатор делает еще один разрыв в ДНК, чтобы прекратить синтез первой (ведущей) цепи. РНК-полимераза и ДНК-полимераза III затем реплицируют ДНК одноцепочечного происхождения (SSO), образуя еще один двухцепочечный круг. ДНК-полимераза I удаляет праймер, заменяя его ДНК, а ДНК-лигаза соединяет концы, образуя еще одну молекулу двухцепочечной кольцевой ДНК.

Подводя итог, можно сказать, что типичная репликация катящегося круга ДНК состоит из пяти этапов: [2]

  1. Круговая дцДНК будет «разрезана».
  2. удлиняется 3'-конец с использованием «неразрезанной» ДНК в качестве ведущей цепи (матрицы); 5'-конец смещен.
  3. Смещенная ДНК представляет собой отстающую цепь, которая образуется двухцепочечной посредством ряда фрагментов Оказаки .
  4. Репликация как «неповрежденных», так и смещенных оцДНК.
  5. Смещенная ДНК циркулирует.

Вирусология

[ редактировать ]

Репликация вирусной ДНК

[ редактировать ]

Некоторые ДНК-вирусы реплицируют свою геномную информацию в клетках-хозяевах посредством репликации по катящемуся кругу. Например, вирус герпеса человека-6 (HHV-6)(hibv) экспрессирует набор «ранних генов», которые, как полагают, участвуют в этом процессе. [3] Получающиеся в результате длинные конкатемеры впоследствии расщепляются рибозимами между областями pac-1 и pac-2 генома HHV-6, когда он упаковывается в отдельные вирионы. [4]

Модель репликации вращающегося круга HPV16.

Вирус папилломы человека-16 (ВПЧ-16) — еще один вирус, который использует скользящую репликацию для быстрого производства потомства. ВПЧ-16 инфицирует эпителиальные клетки человека и имеет двухцепочечный кольцевой геном. Во время репликации в начале гексамер Е1 оборачивается вокруг одноцепочечной ДНК и движется в направлении от 3’ к 5’. При нормальной двунаправленной репликации два репликационных белка диссоциируются во время столкновения, но считается, что при ВПЧ-16 гексамер E1 не диссоциирует, что приводит к непрерывной катящейся репликации. Считается, что этот механизм репликации ВПЧ может иметь физиологическое значение для интеграции вируса в хромосому хозяина и возможного развития рака шейки матки. [5]

Кроме того, геминивирус также использует репликацию по катящемуся кругу в качестве механизма репликации. Этот вирус ответственен за уничтожение многих основных сельскохозяйственных культур, таких как маниока, хлопок, бобовые, кукуруза, томаты и бамия. Вирус имеет кольцевую одноцепочечную ДНК, которая реплицируется в клетках растения-хозяина. Весь процесс инициируется белком-инициатором репликации геминивируса Rep, который также отвечает за изменение среды хозяина, действуя как часть механизма репликации. Rep также поразительно похож на большинство других белков-инициаторов вращающейся репликации эубактерий с наличием мотивов I, II и III на N-конце. Во время репликации по катящемуся кругу оцДНК геминивируса преобразуется в дцДНК, а Rep затем присоединяется к дцДНК в исходной последовательности TAATATTAC. После того, как Rep вместе с другими белками репликации связывается с дцДНК, он образует стволовую петлю, где ДНК затем расщепляется по последовательности наномера, вызывая смещение цепи. Это смещение позволяет репликационной вилке двигаться в направлении от 3’ к 5’, что в конечном итоге приводит к образованию новой цепи оцДНК и конкатамерной цепи ДНК. [6]

бактериофага Т4 Промежуточные продукты репликации ДНК включают кольцевые и разветвленные кольцевые конкатемерные структуры. [7] Эти структуры, вероятно, отражают механизм репликации по катящемуся кругу.

Репликация вирусной РНК

[ редактировать ]

Некоторые РНК-вирусы и вироиды также реплицируют свой геном посредством репликации РНК по принципу катящегося круга. Для вироидов существует два альтернативных пути репликации РНК, которым следуют представители семейства Pospiviroidae (асимметричная репликация) и Avsunviroidae (симметричная репликация) соответственно.

Репликация вирусной РНК по катящемуся кругу

В семействе Pospiviroidae (PSTVd-подобные) кольцевая плюс-цепь РНК транскрибируется РНК-полимеразой хозяина в олигомерные минус-цепи, а затем в олигомерные плюс-цепи. [8] Эти олигомерные плюс-цепи расщепляются РНКазой хозяина и лигируются РНК-лигазой хозяина с образованием мономерной плюс-цепи кольцевой РНК. Это называется асимметричным путем репликации по катящемуся кругу. Вироиды семейства Avsunviroidae (ASBVd-подобные) реплицируют свой геном посредством симметричного пути репликации по катящемуся кругу. [9] В этом симметричном пути олигомерные минус-цепи сначала расщепляются и лигируются с образованием мономерных минус-цепей, а затем транскрибируются в олигомерные плюс-цепи. Эти олигомерные плюс-цепи затем расщепляются и лигируются для образования мономерной плюс-цепи. Симметричный путь репликации получил свое название потому, что плюсовые и минусовые цепи образуются одинаково.

Расщепление олигомерных плюсовых и минусовых цепей опосредуется саморасщепляющейся структурой рибозима «головка молотка», присутствующей у Avsunviroidae, но такая структура отсутствует у Pospiviroidae. [10]

Усиление по катящемуся кругу (RCA)

[ редактировать ]
Молекулярный механизм усиления по вращающемуся кругу (RCA)

Производная форма репликации по катящемуся кругу успешно использовалась для амплификации ДНК из очень небольших количеств исходного материала. [1] Этот метод усиления называется усилением по катящемуся кругу (RCA). В отличие от традиционных методов амплификации ДНК, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) , RCA представляет собой метод изотермической амплификации нуклеиновых кислот , при котором полимераза непрерывно добавляет отдельные нуклеотиды к праймеру, отожженному с кольцевой матрицей, что приводит к образованию длинной конкатемерной оцДНК, содержащей от десятков до сотен тандемных повторов (дополняющих круговой шаблон). [11]

Для проведения реакции RCA необходимы пять важных компонентов:

  1. ДНК-полимераза
  2. Подходящий буфер, совместимый с полимеразой.
  3. Короткий праймер для ДНК или РНК
  4. Круглый шаблон ДНК
  5. Дезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTP)
Методы обнаружения продукта RCA

Полимеразами, используемыми в RCA, являются Phi29 , Bst и Vent экзо -ДНК-полимераза для амплификации ДНК и РНК-полимераза T7 для амплификации РНК. Поскольку ДНК-полимераза Phi29 обладает лучшей процессивностью и способностью к смещению цепи среди всех вышеупомянутых полимераз, ее чаще всего использовали в реакциях RCA. В отличие от полимеразной цепной реакции (ПЦР), RCA можно проводить при постоянной температуре (от комнатной температуры до 65°C) как в свободном растворе, так и поверх иммобилизованных мишеней (твердофазная амплификация).

Обычно реакция ДНК RCA состоит из трех этапов:

  1. Лигирование по круговой матрице, которое можно проводить с помощью ферментативного лигирования, опосредованного матрицей (например, ДНК-лигазы Т4) или лигирования без матрицы с использованием специальных ДНК-лигаз (например, CircLigase).
  2. праймером Элонгация одноцепочечной ДНК, индуцированная . Для гибридизации с одним и тем же кругом можно использовать несколько праймеров. В результате могут быть инициированы множественные события амплификации с образованием нескольких продуктов RCA («Multiprimed RCA»).
  3. Обнаружение и визуализация продуктов амплификации, которая чаще всего проводится посредством флуоресцентного обнаружения, с конъюгированным с флуорофором dNTP, связанными с флуорофором дополнительными или флуоресцентно-меченными молекулярными маяками . Помимо флуоресцентных подходов, гель-электрофорез . для обнаружения продукта RCA также широко используется

RCA производит линейную амплификацию ДНК, поскольку каждая кольцевая матрица растет с заданной скоростью в течение определенного периода времени. Чтобы увеличить выход и добиться экспоненциальной амплификации, как это делает ПЦР, было исследовано несколько подходов. Одним из них является амплификация по сверхразветвленному катящемуся кругу или HRCA, при которой добавляются и удлиняются праймеры, которые отжигаются с исходными продуктами RCA. [12] Таким образом, исходный RCA создает больше шаблонов, которые можно усилить. Другой вариант - амплификация по кругу или C2CA, где продукты RCA расщепляются ферментом рестрикции и лигируются в новые кольцевые матрицы с использованием рестрикционного олигонуклеотида, после чего следует новый раунд RCA с большим количеством кольцевых матриц для амплификации. [13]

Приложения RCA

[ редактировать ]
иллюстрация иммуно-RCA

RCA может усиливать одно событие молекулярного связывания более чем в тысячу раз, что делает его особенно полезным для обнаружения целей со сверхнизким содержанием. Реакции RCA можно проводить не только в среде свободного раствора, но также на твердой поверхности, такой как стекло, микро- или наношарики, планшеты с микролунками, микрофлюидные устройства или даже бумажные полоски. Эта особенность делает его очень мощным инструментом для усиления сигналов в твердофазных иммуноанализах (например, ELISA ). Таким образом, RCA становится универсальным инструментом усиления сигнала с широким спектром применений в геномике, протеомике, диагностике и биосенсорстве.

Иммуно-RCA

[ редактировать ]

Immuno-RCA — это изотермический метод усиления сигнала для высокоспецифичного и высокочувствительного обнаружения и количественного определения белков. Этот метод объединяет две области: RCA, который позволяет амплифицировать нуклеотиды, и иммуноанализ, в котором используются антитела, специфичные к внутриклеточным или свободным биомаркерам. В результате иммуно-RCA дает специфический усиленный сигнал (высокое соотношение сигнал/шум), что делает его пригодным для обнаружения, количественного определения и визуализации белковых маркеров с низким содержанием в жидкофазных иммуноанализах. [14] [15] [16] и иммуногистохимия .

Иммуно-RCA следует за типичной иммуноадсорбентной реакцией при ELISA или иммуногистохимическом окрашивании тканей. [17] Детектирующие антитела, используемые в реакции иммуно-RCA, модифицируются путем присоединения олигонуклеотида оцДНК к концу тяжелых цепей. Таким образом, участок Fab (фрагмент, связывание антигена) детектирующего антитела все еще может связываться со специфическими антигенами, а олигонуклеотид может служить праймером для реакции RCA.

Типичная процедура иммуно-RCA, опосредованная антителами, выглядит следующим образом:

Иллюстрация иммуно-rca на основе аптамера

1. Детектирующее антитело распознает конкретную белковую мишень. Это антитело также прикреплено к олигонуклеотидному праймеру.

2. Если присутствует кольцевая ДНК, ее отжигают, и праймер соответствует комплементарной последовательности кольцевой ДНК.

3. Комплементарная последовательность кольцевой ДНК-матрицы копируется сотни раз и остается прикрепленной к антителу.

4. Выход RCA (удлиненная оцДНК) обнаруживается с помощью флуоресцентных зондов с использованием флуоресцентного микроскопа или устройства для считывания микропланшетов.

аптамера Иммуно-RCA на основе [18]

[ редактировать ]

В дополнение к иммуно-RCA, опосредованному антителами, праймер RCA оцДНК также может быть конъюгирован с 3'-концом аптамера ДНК. Хвост праймера можно амплифицировать посредством амплификации по катящемуся кругу. Продукт можно визуализировать посредством маркировки флуоресцентного репортера. [19] Процесс показан на рисунке справа.

Другие применения RCA

[ редактировать ]

Различные производные RCA широко использовались в области биосенсорства. Например, RCA успешно использовался для обнаружения наличия вирусной и бактериальной ДНК в клинических образцах. [20] [21] что очень полезно для быстрой диагностики инфекционных заболеваний . Он также использовался в качестве метода усиления сигнала на чипе для анализа нуклеиновых кислот (как для ДНК, так и для РНК) на микрочипах . [1]

Помимо функции амплификации в приложениях биосенсора, метод RCA может применяться для создания наноструктур ДНК и гидрогелей также ДНК. Продукты RCA также можно использовать в качестве шаблонов для периодической сборки нановидов или белков, синтеза металлических нанопроволок. [22] и образование наноостровков. [1]

См. также

[ редактировать ]

Ссылки

[ редактировать ]
  1. ^ Jump up to: а б с д Али, М. Монсур; Ли, Фэн; Чжан, Чжицин; Чжан, Кайсян; Канг, Донг-Ку; Анкрам, Джеймс А.; Ле, X. Крис; Чжао, Вэйан (2014). «Усиление по катящемуся кругу: универсальный инструмент для химической биологии, материаловедения и медицины». Обзоры химического общества . 43 (10): 3324–41. дои : 10.1039/C3CS60439J . ПМИД   24643375 .
  2. ^ Демидов, Вадим В, изд. (2016). Усиление по катящемуся кругу (RCA) – к новой клинической практике | Вадим Владимирович Демидов | Спрингер . Спрингер. дои : 10.1007/978-3-319-42226-8 . ISBN  9783319422244 . S2CID   30024718 .
  3. ^ Арбакл, Джесси (2011). «Молекулярная биология латентного периода вируса герпеса-6 человека и интеграции теломер» . Микробы и инфекции . 13 (8–9): 731–741. дои : 10.1016/j.micinf.2011.03.006 . ПМК   3130849 . ПМИД   21458587 .
  4. ^ Боренштейн, Ронен; Френкель, Низа (2009). «Клонирование генома вируса герпеса человека 6А в искусственные бактериальные хромосомы и исследование промежуточных продуктов репликации ДНК» . Труды Национальной академии наук . 106 (45): 19138–19143. Бибкод : 2009PNAS..10619138B . дои : 10.1073/pnas.0908504106 . ПМЦ   2767366 . ПМИД   19858479 .
  5. ^ Кусумото-Мацуо, Рика; Канда, Тадахито; Кукимото, Ивао (01 января 2011 г.). «Репликация ДНК вируса папилломы человека типа 16 по катящемуся кругу в экстрактах эпителиальных клеток» . Гены в клетки . 16 (1): 23–33. дои : 10.1111/j.1365-2443.2010.01458.x . ISSN   1365-2443 . ПМИД   21059156 . S2CID   30493728 .
  6. ^ Ризви, Ирум; Чоудхури, Нирупам Рой; Тутеджа, Нарендра (01 февраля 2015 г.). «Понимание функциональных характеристик белка-инициатора репликации геминивируса по вращающемуся кругу и его взаимодействия с факторами хозяина, влияющими на репликацию вирусной ДНК». Архив вирусологии . 160 (2): 375–387. дои : 10.1007/s00705-014-2297-7 . ISSN   0304-8608 . ПМИД   25449306 . S2CID   16502010 .
  7. ^ Бернштейн Х., Бернштейн С. (июль 1973 г.). «Кольцевые и разветвленные кольцевые соединения как возможные промежуточные соединения в репликации ДНК бактериофага Т4». Дж. Мол. Биол . 77 (3): 355–61. дои : 10.1016/0022-2836(73)90443-9 . ПМИД   4580243 .
  8. ^ Дарос, Хосе-Антонио; Елена, Сантьяго Ф.; Флорес, Рикардо (июнь 2006 г.). «Вироиды: нить Ариадны в лабиринте РНК» . Отчеты ЭМБО . 7 (6): 593–598. дои : 10.1038/sj.embor.7400706 . ISSN   1469-221X . ПМЦ   1479586 . ПМИД   16741503 .
  9. ^ Цагрис, Эфтимия Мина; Мартинес де Альба, Анхель Эмилио; Гозманова, Мариана; Калантидис, Критон (1 ноября 2008 г.). «Вироиды» . Клеточная микробиология . 10 (11): 2168–2179. дои : 10.1111/j.1462-5822.2008.01231.x . ISSN   1462-5822 . ПМИД   18764915 .
  10. ^ Флорес, Рикардо; Гас, Мария-Евгения; Молина-Серрано, Диего; Нохалес, Мария-Анхелес; Карбонелл, Альберто; Заика, Сельма; Де ла Пенья, Маркос; Дарос, Хосе-Антонио (14 сентября 2009 г.). «Репликация вироидов: вращающиеся круги, ферменты и рибозимы» . Вирусы . 1 (2): 317–334. дои : 10.3390/v1020317 . ПМК   3185496 . ПМИД   21994552 .
  11. ^ Али, М. Монсур; Ли, Фэн; Чжан, Чжицин; Чжан, Кайсян; Канг, Донг-Ку; Анкрам, Джеймс А.; Ле, X. Крис; Чжао, Вэйан (21 мая 2014 г.). «Усиление по катящемуся кругу: универсальный инструмент для химической биологии, материаловедения и медицины». Обзоры химического общества . 43 (10): 3324–3341. дои : 10.1039/c3cs60439j . ISSN   1460-4744 . ПМИД   24643375 .
  12. ^ Лизарди, Пол М.; Хуан, Сяохуа; Чжу, Чжэнжун; Брей-Уорд, Патрисия; Томас, Дэвид С.; Уорд, Дэвид К. (июль 1998 г.). «Обнаружение мутаций и подсчет одиночных молекул с использованием изотермической амплификации по катящемуся кругу» . Природная генетика . 19 (3): 225–232. дои : 10.1038/898 . ISSN   1546-1718 . ПМИД   9662393 . S2CID   21007563 .
  13. ^ Даль, Фредрик; Банер, Йохан; Гуллберг, Матс; Мендель-Хартвиг, Марита; Ландегрен, Ульф; Нильссон, Матс (30 марта 2004 г.). «Амплификация от круга к кругу для точного и чувствительного анализа ДНК» . Труды Национальной академии наук . 101 (13): 4548–4553. Бибкод : 2004PNAS..101.4548D . дои : 10.1073/pnas.0400834101 . ISSN   0027-8424 . ПМЦ   384784 . ПМИД   15070755 .
  14. ^ Швейцер, Барри; Робертс, Скотт; Гримуэйд, Брайан; Шао, Вэйпин; Ван, Минджуан; Фу, Цинь; Шу, Квипинг; Ларош, Изабель; Чжоу, Чжиминь (апрель 2002 г.). «Мультиплексное профилирование белков на микрочипах методом амплификации по катящемуся кругу» . Природная биотехнология . 20 (4): 359–365. дои : 10.1038/nbt0402-359 . ISSN   1087-0156 . ПМЦ   2858761 . ПМИД   11923841 .
  15. ^ Чжоу, Лонг; Оу, Ли-Хуан; Чу, Ся; Шен, Го-Ли; Ю, Жу-Цинь (2007). «Амплификация по катящемуся кругу на основе аптамера: платформа для электрохимического обнаружения белка». Аналитическая химия . 79 (19): 7492–7500. дои : 10.1021/ac071059s . ПМИД   17722881 .
  16. ^ Бьёркестен, Йохан; Патил, Сураб; Фредолини, Клаудия; Лённ, Питер; Ландегрен, Ульф (29 мая 2020 г.). «Мультиплексная платформа для цифрового измерения продуктов реакции кольцевой ДНК» . Исследования нуклеиновых кислот . 48 (13): гкаа419. дои : 10.1093/nar/gkaa419 . ISSN   0305-1048 . ПМЦ   7367203 . ПМИД   32469060 .
  17. ^ Гусев Ю.; Спарковски Дж.; Рагунатан, А.; Фергюсон, Х.; Монтано, Дж.; Богдан Н.; Швейцер, Б.; Уилтшир, С.; Кингсмор, Сан-Франциско (июль 2001 г.). «Амплификация по катящемуся кругу: новый подход к повышению чувствительности иммуногистохимии и проточной цитометрии» . Американский журнал патологии . 159 (1): 63–69. дои : 10.1016/S0002-9440(10)61674-4 . ISSN   0002-9440 . ПМК   1850404 . ПМИД   11438455 .
  18. ^ Чжао, Вэйан; Али, М. Монсур; Брук, Майкл А.; Ли, Инфу (11 августа 2008 г.). «Амплификация по катящемуся кругу: применение в нанотехнологиях и биодетектировании с помощью функциональных нуклеиновых кислот». Angewandte Chemie, международное издание . 47 (34): 6330–6337. дои : 10.1002/anie.200705982 . ISSN   1521-3773 . ПМИД   18680110 .
  19. ^ Чжоу, Лонг; Оу, Ли-Хуан; Чу, Ся; Шен, Го-Ли; Ю, Жу-Цинь (01 октября 2007 г.). «Амплификация по катящемуся кругу на основе аптамера: платформа для электрохимического обнаружения белка». Аналитическая химия . 79 (19): 7492–7500. дои : 10.1021/ac071059s . ISSN   0003-2700 . ПМИД   17722881 .
  20. ^ Чен, Сяою; Ван, Бин; Ян, Вэнь; Конг, Фаньронг; Ли, Чуанью; Сунь, Чжаоган; Джелфс, Питер; Гилберт, Гвендолин Л. (1 мая 2014 г.). «Амплификация по методу катящегося круга для прямого обнаружения мутаций гена rpoB в изолятах микобактерий туберкулеза из клинических образцов» . Журнал клинической микробиологии . 52 (5): 1540–1548. дои : 10.1128/JCM.00065-14 . ISSN   0095-1137 . ПМЦ   3993705 . ПМИД   24574296 .
  21. ^ Лю, Ян; Го, Ян-Лин; Цзян, Гуан-Лу; Чжоу, Ши-Цзе; Солнце, Ци; Чен, Си; Чанг, Сю-Цзюнь; Син, Ай-Ин; Ду, Фэн-Цзяо (04 июня 2013 г.). «Применение гиперразветвленной амплификации по катящемуся кругу для прямого обнаружения микобактерий туберкулеза в клинических образцах мокроты» . ПЛОС ОДИН . 8 (6): e64583. Бибкод : 2013PLoSO...864583L . дои : 10.1371/journal.pone.0064583 . ISSN   1932-6203 . ПМЦ   3672175 . ПМИД   23750210 .
  22. ^ Го, Маосян; Эрнандес-Нейта, Иван; Мадабуси, Нараянан; Нильссон, Матс; Вейнгаарт, Воутер ван дер (12 февраля 2018 г.). «Эффективный синтез трансмембранных золотых нанопроводов с помощью ДНК» . Микросистемы и наноинженерия . 4 : 17084. дои : 10.1038/micronano.2017.84 . ISSN   2055-7434 .
[ редактировать ]
Retrieved from "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Rolling_circle_replication&oldid=1234861661"
Arc.Ask3.Ru: конец переведенного документа.
Arc.Ask3.Ru
Номер скриншота №: ef5c9db754bb6d9556ef2658bb014e5b__1721129640
URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/ef/5b/ef5c9db754bb6d9556ef2658bb014e5b.html
Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1:
Rolling circle replication - Wikipedia
Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)