Перенос ДНК
Транспортная ДНК (сокращенно Т-ДНК ) представляет собой перенесенную ДНК индуцирующей опухоль (Ti) плазмиды некоторых видов бактерий, таких как Agrobacterium tumefaciens и Agrobacterium rhizogenes (фактически Ri-плазмида) . Т-ДНК переносится из бактерии в ядерной ДНК геном растения-хозяина . [1] Способность этой специализированной опухолеиндуцирующей (Ti) плазмиды объясняется двумя важными областями, необходимыми для переноса ДНК в клетку-хозяина. Т-ДНК окружена повторами из 25 пар оснований на каждом конце. Перенос начинается на правой границе и заканчивается на левой границе и требует генов vir плазмиды Ti.
Бактериальная Т-ДНК имеет длину около 24 000 пар оснований. [2] [3] и содержит экспрессируемые в растениях гены , которые кодируют ферменты, синтезирующие опины и фитогормоны . Перенося Т-ДНК в геном растения, бактерия по существу перепрограммирует растительные клетки, чтобы они превратились в опухоль и произвели уникальный источник пищи для бактерий. Синтез растительных гормонов ауксина и цитокинина ферментами, закодированными в Т-ДНК, позволяет растительной клетке разрастаться, образуя таким образом опухоли корончатого галла, обычно индуцированные инфекцией Agrobacterium tumefaciens . [4] Agrobacterium rhizogenes вызывает подобную инфекцию, известную как болезнь волосатого корня . Опины производные представляют собой аминокислот , используемые бактериями в качестве источника углерода и энергии. Этот естественный процесс горизонтального переноса генов в растениях используется в качестве инструмента для фундаментальных и прикладных исследований в биологии растений посредством трансформации чужеродных генов, опосредованной Agrobacterium tumefaciens , и инсерционного мутагенеза. [5] [6] Геномы растений можно сконструировать с помощью Agrobacterium для доставки последовательностей, содержащихся в бинарных векторах Т-ДНК .
Механизм трансформации в природе
[ редактировать ]Процесс заражения Т-ДНК в клетке-хозяине и интеграции в ее ядро включает несколько этапов. Прежде чем заразиться, бактерии сначала размножаются в соке раны, а затем прикрепляются к стенкам клеток растения. Экспрессия примерно 10 оперонов бактериальных генов вирулентности активируется восприятием фенольных соединений, таких как ацетосирингон, выделяемых поврежденной тканью растения, и следует за межклеточным контактом. Далее этот процесс протекает с макромолекулярной транслокацией из Agrobacterium в цитоплазму клетки-хозяина, передачей Т-ДНК вместе со связанными с ней белками (так называемыми Т-комплексами ) в ядро клетки-хозяина с последующей разборкой Т-комплекса, стабильной интеграцией Т- ДНК в геном растения-хозяина и возможная экспрессия перенесенных генов . Интеграция Т-ДНК в геном хозяина включает образование одноцепочечного разрыва в ДНК на правой границе плазмиды Ti. Этот разрыв создает участок одноцепочечной ДНК от левого края гена Т-ДНК до разрезанного правого края. Затем одноцепочечные связывающие белки прикрепляются к одноцепочечной ДНК. Синтез ДНК замещает одноцепочечный участок, а затем второй разрыв в левой пограничной области высвобождает одноцепочечный фрагмент Т-ДНК. В дальнейшем этот фрагмент может быть встроен в геном хозяина. [7]
Agrobacterium Известно, что разработала систему контроля, которая использует факторы растения-хозяина и клеточные процессы для нескольких путей защитной реакции растения-хозяина на вторжение в ядро клетки-хозяина. Для интеграции Т-ДНК в целевой геном хозяина Agrobacterium осуществляет многочисленные взаимодействия с факторами растения-хозяина. [7] Для взаимодействия с белками растения-хозяина многие белки вирулентности Agrobacterium кодируются генами vir. Экспрессия гена Agrobacterium vir происходит через сенсор VirA-VirG, что приводит к образованию мобильной одноцепочечной копии Т-ДНК (Т-цепи). Процессированная форма VirB2 является основным компонентом Т-комплекса, необходимым для трансформации. VirD2 представляет собой белок, который блокирует 5'-конец перенесенной Т-цепи посредством ковалентного прикрепления и транспортируется в цитоплазму клетки-хозяина. [8] [9] VirE2 представляет собой одноцепочечный ДНК-связывающий белок, который предположительно покрывает Т-цепь в цитоплазме хозяина путем кооперативного связывания . Затем он направляется в ядро посредством взаимодействия с белками клетки-хозяина, такими как импортин a, бактериальный VirE3 и динеиноподобные белки. Некоторые другие бактериальные эффекторы вирулентности, такие как VirB5, VirB7 (минорные компоненты Т-комплекса), VirD5, VirE2, VirE3 и VirF, которые также могут взаимодействовать с белками клеток растения-хозяина. [10]
Использование в биотехнологии
[ редактировать ]Перенос Т-ДНК, опосредованный агробактериями, широко используется в качестве инструмента в биотехнологии . Уже более двух десятилетий Agrobacterium tumefaciens используется для введения генов в растения для фундаментальных исследований, а также для коммерческого производства трансгенных культур . [11] В генной инженерии гены, способствующие развитию опухолей и синтезирующие опины, удаляются из Т-ДНК и заменяются интересующим геном и/или маркером селекции, который необходим для установления того, какие растения были успешно трансформированы. Примеры маркеров селекции включают неомицин фосфотрансферазу, гигромицин B фосфотрансферазу (которая фосфорилирует антибиотики) и фосфинотрицин ацетилтрансферазу (которая ацетилирует и дезактивирует фосфинотрицин , мощный ингибитор глутаминсинтетазы ) или гербицидные составы, такие как Баста или Биалофос. [12] Другой системой селекции, которую можно использовать, является использование метаболических маркеров, таких как фосфоманнозоизомераза. [13] Затем Agrobacterium используется в качестве вектора для переноса сконструированной Т-ДНК в растительные клетки, где она интегрируется в геном растения. Этот метод можно использовать для создания трансгенных растений, несущих чужеродный ген. Agrobacterium tumefaciens способна эффективно переносить чужеродную ДНК как на однодольные , так и на двудольные растения, принимая во внимание критически важные факторы, такие как генотип растений, типы и возраст инокулируемых тканей, виды векторов, штаммы Agrobacterium , гены-маркеры селекции и селективные агенты. и различные условия культуры тканей. [4]
Та же процедура переноса Т-ДНК может быть использована для разрушения генов посредством инсерционного мутагенеза . [6] Вставленная последовательность Т-ДНК не только создает мутацию, но и «маркирует» ее. [14] затронутый ген, что позволяет выделить его в виде фланкирующих последовательностей Т-ДНК. Репортерный ген может быть связан с правым концом Т-ДНК для трансформации вместе с плазмидным репликоном и селектируемым геном устойчивости к антибиотику (например, гигромицину ) и может обеспечивать примерно 30% средней эффективности при успешных вставках Т-ДНК. индуцированные слияния генов у Arabidopsis thaliana . [15]
Обратная генетика предполагает тестирование предполагаемой функции известного гена путем его разрушения, а затем поиск влияния этой вызванной мутации на фенотип организма. Мутагенез с мечением Т-ДНК включает в себя скрининг популяций по инсерционным мутациям Т-ДНК. Коллекции известных мутаций Т-ДНК предоставляют ресурсы для изучения функций отдельных генов, разработанных для модельного растения Arabidopsis thaliana . [16] Примеры инсерционных мутаций Т-ДНК у Arabidopsis thaliana включают те, которые связаны со многими классами фенотипов, включая гибель проростков, варианты размера, варианты пигмента, дефекты эмбрионов, пониженную плодовитость и морфологически или физиологически аберрантные растения. [17]
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Гелвин, Стэнтон Б. (27 ноября 2017 г.). «Интеграция Т-ДНК агробактерий в геном растения» . Ежегодный обзор генетики . 51 (1): 195–217. doi : 10.1146/annurev-genet-120215-035320 . ISSN 0066-4197 . ПМИД 28853920 .
- ^ Баркер Р.Ф., Айдлер К.Б., Томпсон Д.В., Кемп Дж.Д. (ноябрь 1983 г.). «Нуклеотидная последовательность области тДНК из плазмиды A grobacterium tumefaciens октопин Ti pTi15955». Молекулярная биология растений . 2 (6): 335–50. дои : 10.1007/BF01578595 . ПМИД 24318453 . S2CID 26118909 .
- ^ Гилен Дж., Террин Н., Вильярроэль Р., Ван Монтегю М. (1 августа 1999 г.). «Полная нуклеотидная последовательность области тДНК плазмиды pTiC58 Agrobacterium tumefaciens Ti, индуцирующей опухоли растений» . Журнал экспериментальной ботаники . 50 (337): 1421–1422. дои : 10.1093/jxb/50.337.1421 . ISSN 0022-0957 .
- ^ Jump up to: а б Хиэй Ю, Комари Т, Кубо Т (сентябрь 1997 г.). «Трансформация риса, опосредованная Agrobacterium tumefaciens». Молекулярная биология растений . 35 (1–2): 205–18. дои : 10.1023/а:1005847615493 . ПМИД 9291974 . S2CID 19196285 .
- ^ Зупан-младший, Замбриски П. (апрель 1995 г.). «Перенос тДНК из агробактерий в растительную клетку» . Физиология растений . 107 (4): 1041–7. дои : 10.1104/стр.107.4.1041 . ПМЦ 157234 . ПМИД 7770515 .
- ^ Jump up to: а б Крисан П.Дж., Янг Дж.К., Сассман М.Р. (декабрь 1999 г.). «Т-ДНК как инсерционный мутаген у Arabidopsis» . Растительная клетка . 11 (12): 2283–90. дои : 10.1105/tpc.11.12.2283 . ПМК 144136 . ПМИД 10590158 .
- ^ Jump up to: а б Лакруа Б, Цитовский В (2013). «Роль факторов бактерий и растений-хозяев в генетической трансформации, опосредованной Agrobacterium» . Международный журнал биологии развития . 57 (6–8): 467–81. doi : 10.1387/ijdb.130199bl . ПМЦ 9478875 . ПМИД 24166430 .
- ^ Куколикова-Никола З., Райнери Д., Стивенс К., Рамос С., Тинланд Б., Нестер Э.В., Хон Б. (февраль 1993 г.). «Генетический анализ оперона virD Agrobacterium tumefaciens: поиск функций, участвующих в транспорте Т-ДНК в ядро растительной клетки и в интеграции Т-ДНК» . Журнал бактериологии . 175 (3): 723–31. дои : 10.1128/jb.175.3.723-731.1993 . ЧВК 196211 . ПМИД 8380800 .
- ^ Арья А (февраль 2017 г.). «Патология агробактерий и векторный дизайн на основе Ti-плазмиды». Примечания высокой ценности . 4 (1): 1–24. дои : 10.13140/RG.2.2.18345.49769/1 .
- ^ Гельвин С.Б. (март 2003 г.). «Трансформация растений с помощью агробактерий: биология, лежащая в основе инструмента «генной борьбы»» . Обзоры микробиологии и молекулярной биологии . 67 (1): 16–37, оглавление. дои : 10.1128/ммбр.67.1.16-37.2003 . ПМК 150518 . ПМИД 12626681 .
- ^ Олтманс Х., Фрейм Б, Ли Л.И., Джонсон С., Ли Б., Ван К., Гельвин С.Б. (март 2010 г.). «Получение беспозвоночных растений с низким содержанием трансгенов путем запуска Т-ДНК из хромосомы Agrobacterium» . Физиология растений . 152 (3): 1158–66. дои : 10.1104/стр.109.148585 . ПМЦ 2832237 . ПМИД 20023148 .
- ^ Ли Л.И., Гелвин С.Б. (февраль 2008 г.). «Бинарные векторы и системы тДНК» . Физиология растений . 146 (2): 325–32. дои : 10.1104/стр.107.113001 . ПМК 2245830 . ПМИД 18250230 .
- ^ Тодд Р., Тейг BW (1 декабря 2001 г.). «Фосфоманнозоизомераза: универсальный селектируемый маркер для трансформации зародышевой линии Arabidopsis thaliana». Репортер по молекулярной биологии растений . 19 (4): 307–319. дои : 10.1007/bf02772829 . ISSN 0735-9640 . S2CID 46196053 .
- ^ Лю Ю.Г., Ширано Ю., Фукаки Х., Янаи Ю., Тасака М., Табата С., Сибата Д. (май 1999 г.). «Комплементация растительных мутантов большими фрагментами геномной ДНК компетентным к трансформации искусственным хромосомным вектором ускоряет позиционное клонирование» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 96 (11): 6535–40. Бибкод : 1999PNAS...96.6535L . дои : 10.1073/pnas.96.11.6535 . ПМК 26917 . ПМИД 10339623 .
- ^ Конц С., Мартини Н., Майерхофер Р., Конц-Кальман З., Кёрбер Х., Редей Г.П., Шелл Дж. (ноябрь 1989 г.). «Высокочастотное мечение генов, опосредованное Т-ДНК, у растений» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 86 (21): 8467–71. Бибкод : 1989PNAS...86.8467K . дои : 10.1073/pnas.86.21.8467 . ПМК 298303 . ПМИД 2554318 .
- ^ Бен-Амар А., Далдул С., Реустл ГМ, Крчал Г., Млики А. (декабрь 2016 г.). «Обратная генетика и методологии высокопроизводительного секвенирования для функциональной геномики растений» . Современная геномика . 17 (6): 460–475. дои : 10.2174/1389202917666160520102827 . ПМЦ 5282599 . ПМИД 28217003 .
- ^ Фельдманн К.А. (1 июля 1991 г.). «Инсерционный мутагенез Т-ДНК у арабидопсиса: мутационный спектр» . Заводской журнал . 1 (1): 71–82. дои : 10.1111/j.1365-313x.1991.00071.x . ISSN 1365-313X .
Дальнейшее чтение
[ редактировать ]- Рэйвен П.Х., Эверт Р.Ф., Эйххорн С.Е. (2005). Биология растений (7-е изд.). Нью-Йорк: Издатели WH Freeman and Company. ISBN 0-7167-1007-2 .