Обратная трансфекция

Обратная трансфекция — это метод переноса генетического материала в клетки . Поскольку ДНК печатается на предметном стекле, чтобы процесс трансфекции (преднамеренного введения нуклеиновых кислот в клетки) происходил до добавления прикрепившихся клеток, порядок добавления ДНК и прикрепившихся клеток обратный порядку обычной трансфекции . ^[1] Поэтому и используется слово «обратный».

Процесс

Подготовка трансфекционной смеси для печати слайдов

ДНК и Для печати на предметном стекле можно использовать смесь желатина. Порошок желатина сначала растворяют в стерильной воде Milli-Q с образованием 0,2% раствора желатина. Очищенную ДНК- плазмиду затем смешивают с раствором желатина, при этом конечную концентрацию желатина поддерживают выше 0,17%. Помимо желатина, ателоколлаген и фибронектин также являются успешными векторами трансфекции для введения чужеродной ДНК в ядро клетки.

Слайд-печать смеси ДНК и желатина

После приготовления смеси ДНК и желатина смесь наносят пипеткой на поверхность предметного стекла и предметное стекло помещают в закрытую чашку Петри . для В чашку добавляют влагопоглотитель высыхания раствора. Наконец, культивированные клетки выливают в чашку для поглощения плазмиды. Однако с изобретением различных типов систем микрочиповой печати на одном предметном стекле можно печатать сотни трансфекционных смесей (содержащих разные представляющие интерес ДНК) для поглощения плазмид клетками. ^[2] Существует два основных типа систем микроматрицы, производимых разными компаниями: системы контактной и бесконтактной печати.

Примером системы бесконтактной печати является гибкая бесконтактная микроматричная система Piezorray. Он использует контроль давления и пьезоэлектрический воротник для выдавливания последовательных капель объемом примерно 333 пл. Дозаторы PiezoTip не контактируют с поверхностью, на которую наносится образец; таким образом, снижается вероятность загрязнения и устраняется риск повреждения целевой поверхности. Примером системы контактной печати является система контактного определения SpotArray 72 (Perkin Elmer Life Sciences). Его печатающая головка может вместить до 48 игл и создает компактные массивы, выборочно поднимая и опуская подмножества иголок во время печати. После печати булавки промываются мощной моечной машиной высокого давления и сушатся в вакууме, что исключает остатки материала. Другим примером системы контактной печати является система Qarray (Genetix). Имеет три типа систем печати: QArray Mini, QArray 2 и QArray Max. После печати раствору дают высохнуть, и ДНК-желатин плотно прикрепляется к матрице.

HybriWell в обратной трансфекции

Сначала клей с HybriWell удаляется, и HybriWell прикрепляется к участку предметного стекла, напечатанному раствором желатина и ДНК. Во-вторых, 200 мкл трансфекционной смеси вносят пипеткой в один из портов HybriWell; смесь равномерно распределится по массиву. Затем массив инкубируют при температуре и времени, зависящих от используемых типов клеток. с тонким концом В-третьих, смесь для трансфекции отбирают пипеткой, а HybriWell удаляют пинцетом . В-четвертых, напечатанное предметное стекло, обработанное реагентом для трансфекции, помещают в квадратную чашку печатной стороной вверх. В-пятых, собранные клетки аккуратно выливают на предметные стекла (а не на печатные участки). Наконец, чашку помещают в _{с температурой 37°C и 5% CO 2} увлажненный инкубатор и инкубируют в течение ночи.

Другие реагенты для обратной трансфекции

Реагент Effectene используется в сочетании с усилителем и буфером конденсации ДНК (Buffer EC) для достижения высокой эффективности трансфекции. На первом этапе образования комплекса эффектен-ДНК ДНК конденсируется путем взаимодействия с энхансером в системе с определенным буфером. Затем к конденсированной ДНК добавляют реагент эффектен для образования конденсированных комплексов эффектен-ДНК. Комплексы эффектен-ДНК смешивают со средой и добавляют непосредственно к клеткам.Эффектеновый реагент спонтанно образует мицеллярные структуры без изменений размера или партии (что можно обнаружить при использовании предварительно приготовленных липосомальных реагентов). Эта особенность обеспечивает воспроизводимость формирования трансфекционного комплекса. Процесс высокой конденсации молекул ДНК с последующим покрытием их реагентом Effectene является эффективным способом переноса ДНК в эукариотические клетки .

Преимущества и недостатки

Преимущества обратной трансфекции (по сравнению с обычной трансфекцией):

Добавление и прикрепление клеток-мишеней к поверхности, нагруженной ДНК, может привести к более высокой вероятности контакта клетки с ДНК, что потенциально приводит к более высокой эффективности трансфекции. ^[3]
Трудозатратные материалы (требуется меньше ДНК)
Высокопроизводительный досмотр; сотни генов могут быть экспрессированы в клетках на одном микрочипе для изучения экспрессии и регуляции генов . ^[4]
Параллельный посев клеток в одной камере для 384 экспериментов без физического разделения между экспериментами повышает качество данных скрининга . В экспериментах, проведенных в многостенных чашках, наблюдаются вариации от лунки к лунке.
Могут быть изготовлены точные повторяющиеся массивы, поскольку один и тот же исходный планшет с образцом можно высушить и напечатать на разных предметных стеклах в течение как минимум 15 месяцев хранения без видимой потери эффективности трансфекции.

Недостатками обратной трансфекции являются:

Обратная трансфекция обходится дороже, поскольку для печати раствора ДНК-желатина на предметных стеклах необходима высокоточная и эффективная система микрочиповой печати.
Приложения с различными клеточными линиями (до сих пор) требовали изменений протокола для производства массивов миРНК или плазмид, что требует значительных разработок и испытаний.
Повышенная вероятность перекрестного загрязнения массива и пятна по мере увеличения плотности пятна; поэтому оптимизация структуры массива важна. ^[5]

Ссылки

^ «Обратная трансфекция» . Проверено 24 августа 2018 г.
^ Домашняя страница обратной трансфекции , получено 14 октября 2011 г.
^ Эрфле, Х. и др. (2007), «Обратная трансфекция клеточных массивов для скрининга высокого содержания ». Микроскопия, Nat Protoc 2 , 392–399.
^ Нейманн Б. и др., «Высокопроизводительный скрининг РНКи с помощью покадровой визуализации живых клеток человека ». Nat Methods 3, 385–390 (2006).
^ Линии раковых клеток и первичные клетки, полученные 14 октября 2011 г.

[1] «Обратная трансфекция» . Проверено 24 августа 2018 г.

[2] Домашняя страница обратной трансфекции , получено 14 октября 2011 г.

[3] Эрфле, Х. и др. (2007), «Обратная трансфекция клеточных массивов для скрининга высокого содержания ». Микроскопия, Nat Protoc 2 , 392–399.

[4] Нейманн Б. и др., «Высокопроизводительный скрининг РНКи с помощью покадровой визуализации живых клеток человека ». Nat Methods 3, 385–390 (2006).

[5] Линии раковых клеток и первичные клетки, полученные 14 октября 2011 г.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]