Генный нокдаун

Нокдаун генов — это экспериментальный метод, с помощью которого одного или нескольких . генов организма снижается экспрессия Снижение может происходить либо посредством генетической модификации , либо путем обработки реагентом, таким как короткий олигонуклеотид ДНК или РНК , последовательность которого комплементарна либо гену, либо транскрипту мРНК. ^[1]

Против временного нокдауна

Если ДНК организма генетически модифицирована, полученный организм называется «нокдаун-организмом». Если изменение экспрессии гена вызвано связыванием олигонуклеотида с мРНК или временным связыванием с геном , это приводит к временному изменению экспрессии гена, которое не модифицирует хромосомную ДНК, и результат называется «временным нокдауном». ". ^[1]

При временном нокдауне связывание этого олигонуклеотида с активным геном или его транскриптами вызывает снижение экспрессии посредством множества процессов. Связывание может происходить либо за счет блокирования транскрипции (в случае связывания генов), деградации транскрипта мРНК (например, с помощью небольшой интерферирующей РНК ( миРНК )) или РНКазы -H-зависимой антисмысловой, либо за счет блокирования любой из мРНК. трансляции пре-м , сайты сплайсинга РНК или сайты расщепления нуклеазой , используемые для созревания других функциональных РНК, включая микроРНК (например, с помощью морфолиноолигонуклеотидов или других антисмысловых, независимых от РНКазы-H). ^[1]^[2]

Наиболее прямым применением временных нокдаунов является изучение гена , который был секвенирован , но имеет неизвестную или не полностью известную функцию. Этот экспериментальный подход известен как обратная генетика . Исследователи делают выводы на основании того, чем нокдаун отличается от индивидуумов, у которых интересующий ген работает. Временные нокдауны часто используются в биологии развития, поскольку олигонуклеотиды можно инъецировать в одноклеточные зиготы , и они будут присутствовать в дочерних клетках инъецированной клетки в процессе эмбрионального развития. ^[3] Термин «нокдаун гена» впервые появился в литературе в 1994 году. ^[4]

РНК-интерференция

РНК-интерференция (РНКи) — это способ подавления генов путем деградации мРНК. ^[5] Нокдаун гена этим методом достигается путем введения в цитоплазму небольших двухцепочечных интерферирующих РНК (миРНК). Малые интерферирующие РНК могут возникать изнутри клетки или могут быть введены в клетку экзогенно. После введения в клетку экзогенные миРНК обрабатываются РНК-индуцированным комплексом молчания ( RISC ). ^[6] siRNA комплементарна целевой мРНК, подлежащей подавлению, и RISC использует siRNA в качестве матрицы для обнаружения целевой мРНК. После того как RISC локализуется на целевой мРНК, РНК расщепляется рибонуклеазой.

РНКи широко используется в качестве лабораторного метода генетического функционального анализа. ^[7] РНКи в таких организмах, как C. elegans и Drosophila melanogaster, обеспечивает быстрый и недорогой способ исследования функции генов. В исследованиях C. elegans наличие таких инструментов, как Библиотека РНКи Арингера, дает лабораториям возможность тестировать многие гены в различных экспериментальных условиях. Информация, полученная в результате экспериментального использования РНКи, может быть полезна при определении потенциальных терапевтических целей, разработке лекарств или других приложениях. ^[8] РНК-интерференция — очень полезный исследовательский инструмент, позволяющий исследователям проводить масштабные генетические скрининги, пытаясь определить цели для дальнейших исследований, связанных с конкретным путем, лекарством или фенотипом. ^[9]^[10]

CRISPR

Другой способ подавления экзогенной ДНК, обнаруженный у прокариот, — это механизм, включающий локусы, называемые «кластеризованными регулярно расположенными короткими палиндромными повторами» или CRISPR . ^[11] CRISPR-ассоциированные (cas) гены кодируют клеточный механизм, который разрезает экзогенную ДНК на небольшие фрагменты и вставляет их в локус повторов CRISPR. Когда эта область ДНК CRISPR экспрессируется клеткой, небольшие РНК, образующиеся из вставок экзогенной ДНК, служат шаблонной последовательностью, которую другие белки Cas используют для подавления этой же экзогенной последовательности. Транскрипты коротких экзогенных последовательностей используются в качестве руководства для подавления чужеродной ДНК, когда она присутствует в клетке. Это служит своего рода приобретенным иммунитетом, и этот процесс подобен механизму интерференции прокариотической РНК. Повторы CRISPR законсервированы у многих видов, и было продемонстрировано, что их можно использовать в клетках человека. ^[12] бактерии, ^[13] К. Элеганс , ^[14] рыбка данио , ^[15] и других организмов для эффективного манипулирования геномом. Можно проиллюстрировать использование CRISPR в качестве универсального исследовательского инструмента. ^[16] во многих исследованиях его использовали для создания организмов с изменениями генома.

РЕЧЬ

Другая технология, ставшая возможной благодаря манипулированию геномом прокариот, — это использование эффекторных нуклеаз, подобных активаторам транскрипции ( TALEN ), для воздействия на определенные гены. ^[17] TALEN — это нуклеазы, которые имеют два важных функциональных компонента: ДНК-связывающий домен и домен, расщепляющий ДНК. ДНК-связывающий домен представляет собой специфичную для последовательности эффекторную последовательность, подобную активатору транскрипции, тогда как домен, расщепляющий ДНК, происходит от бактериальной эндонуклеазы и является неспецифичным. TALEN можно сконструировать для расщепления последовательности, определенной последовательностью эффекторной части конструкции, подобной активатору транскрипции. После создания TALEN вводится в клетку в виде плазмиды или мРНК. TALEN экспрессируется, локализуется в целевой последовательности и расщепляет определенный сайт. После расщепления целевой последовательности ДНК с помощью TALEN клетка использует негомологичное соединение концов в качестве механизма репарации ДНК для коррекции расщепления. Попытка клетки восстановить расщепленную последовательность может сделать кодируемый белок нефункциональным, поскольку этот механизм восстановления приводит к ошибкам вставки или удаления в восстановленном сайте.

Коммерциализация

До сих пор нокдаун-организмы с необратимыми изменениями в ДНК создавались главным образом для исследовательских целей. Эти организмы , также известные как просто нокдауны , чаще всего используются для обратной генетики, особенно у таких видов, как мыши или крысы , к которым нелегко применить технологии временного нокдауна. ^[3]^[18]

Есть несколько компаний, которые предлагают коммерческие услуги, связанные с лечением нокдауна генов.

См. также

Джин нокаут

Ссылки

^ Перейти обратно: ^а ^б ^с Саммертон Дж. Э. (2007). «Сравнение морфолино, миРНК и S-ДНК: влияние структуры и механизма действия на нецелевые эффекты и специфичность последовательности». Актуальные темы медицинской химии . 7 (7): 651–60. дои : 10.2174/156802607780487740 . ПМИД 17430206 . S2CID 12241724 .
^ Саммертон Дж (декабрь 1999 г.). «Морфолино-антисмысловые олигомеры: случай структурного типа, независимого от РНКазы H». Biochimica et Biophysical Acta (BBA) – Структура и экспрессия генов . 1489 (1): 141–58. дои : 10.1016/S0167-4781(99)00150-5 . ПМИД 10807004 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Назявичюс А., Эккер С.С. (октябрь 2000 г.). «Эффективный целевой «нокдаун» гена у рыбок данио». Природная генетика . 26 (2): 216–20. дои : 10.1038/79951 . ПМИД 11017081 . S2CID 21451111 .
^ Валестедт, Клаас (февраль 1994 г.). «Стратегии антисмысловых олигонуклеотидов в нейрофармакологии». Тенденции Pharmacol Sci . 15 (2): 42–6. дои : 10.1016/0165-6147(94)90107-4 . ПМИД 8165722 .
^ Файр А, Сюй С, Монтгомери МК, Костас С.А., Драйвер С.Е., Мелло CC (февраль 1998 г.). «Мощное и специфическое генетическое вмешательство двухцепочечной РНК в Caenorhabditis elegans». Природа . 391 (6669): 806–11. Бибкод : 1998Natur.391..806F . дои : 10.1038/35888 . ПМИД 9486653 . S2CID 4355692 .
^ Пратт А.Дж., Макрей И.Дж. (июль 2009 г.). «Комплекс молчания, индуцированный РНК: универсальная машина для подавления генов» . Журнал биологической химии . 284 (27): 17897–901. дои : 10.1074/jbc.R900012200 . ПМК 2709356 . ПМИД 19342379 .
^ Фрейзер А.Г., Камат Р.С., Ципперлен П., Мартинес-Кампос М., Зорманн М., Арингер Дж. (ноябрь 2000 г.). «Функциональный геномный анализ хромосомы I C. elegans методом систематической РНК-интерференции». Природа . 408 (6810): 325–30. Бибкод : 2000Natur.408..325F . дои : 10.1038/35042517 . ПМИД 11099033 . S2CID 4373444 .
^ Агаард Л., Росси Джей Джей (март 2007 г.). «РНКи-терапия: принципы, перспективы и проблемы» . Обзоры расширенной доставки лекарств . 59 (2–3): 75–86. дои : 10.1016/j.addr.2007.03.005 . ЧВК 1978219 . ПМИД 17449137 .
^ Камат Р.С., Арингер Дж. (август 2003 г.). «Полногеномный скрининг РНКи у Caenorhabditis elegans». Методы . 30 (4): 313–21. дои : 10.1016/S1046-2023(03)00050-1 . ПМИД 12828945 .
^ Гадакзаде С., Мехаил М., Ауде А., Хамди Р., Табризян М. (март 2016 г.). «Маленькие игроки правят жесткой игрой: миРНК в регенерации костей» . Журнал исследований костей и минералов . 31 (3): 475–87. дои : 10.1002/jbmr.2816 . ПМИД 26890411 .
^ Гилберт Л.А., Ларсон М.Х., Морсут Л., Лю З., Брар Г.А., Торрес С.Е., Стерн-Гиноссар Н., Брандман О., Уайтхед Э.Х., Дудна Дж.А., Лим В.А., Вайсман Дж.С., Ци Л.С. (июль 2013 г.). «CRISPR-опосредованная модульная РНК-регулируемая регуляция транскрипции у эукариот» . Клетка . 154 (2): 442–51. дои : 10.1016/j.cell.2013.06.044 . ПМК 3770145 . ПМИД 23849981 .
^ Эсвелт К.М., Мали П., Брафф Дж.Л., Моосбернер М., Яунг С.Дж., генеральный менеджер Черча (ноябрь 2013 г.). «Ортогональные белки Cas9 для регуляции и редактирования генов, управляемых РНК» (PDF) . Природные методы . 10 (11): 1116–21. дои : 10.1038/nmeth.2681 . ПМЦ 3844869 . ПМИД 24076762 .
^ Цзян В., Бикард Д., Кокс Д., Чжан Ф., Марраффини Л.А. (март 2013 г.). «Редактирование бактериальных геномов под контролем РНК с использованием систем CRISPR-Cas» . Природная биотехнология . 31 (3): 233–9. дои : 10.1038/nbt.2508 . ПМЦ 3748948 . ПМИД 23360965 .
^ Чен С., Фенк Л.А., де Боно М. (ноябрь 2013 г.). «Эффективное редактирование генома Caenorhabditis elegans посредством гомологичной рекомбинации, направленной на CRISPR» . Исследования нуклеиновых кислот . 41 (20): e193. дои : 10.1093/нар/gkt805 . ПМЦ 3814388 . ПМИД 24013562 .
^ Хисано Ю, Ота С, Кавахара А (январь 2014 г.). «Редактирование генома с использованием искусственных сайт-специфичных нуклеаз у рыбок данио» . Развитие, рост и дифференциация . 56 (1): 26–33. дои : 10.1111/dgd.12094 . ПМИД 24117409 .
^ Геннекин Б., Отте Д.М., Циммер А. (ноябрь 2013 г.). «CRISPR/Cas-индуцированные двухцепочечные разрывы повышают частоту замен генов для гуманизации мышиного гена Cnr2». Связь с биохимическими и биофизическими исследованиями . 441 (4): 815–9. дои : 10.1016/j.bbrc.2013.10.138 . ПМИД 24211574 .
^ Сунь Н., Чжао Х. (июль 2013 г.). «Эффектные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN): высокоэффективный и универсальный инструмент для редактирования генома». Биотехнология и биоинженерия . 110 (7): 1811–21. дои : 10.1002/бит.24890 . ПМИД 23508559 . S2CID 6214542 .
^ «Клетки с нокдауном аденовирусного гена» . Сирион Биотех. Архивировано из оригинала 9 июля 2013 года . Проверено 17 апреля 2013 г.

Внешние ссылки

«Ресурсы геномной инженерии CRISPR» . Броудский институт.
«Рука Моджо: создайте свои собственные ТАЛЕНЫ» . Клиника Майо.
«TALEN Effector Nucleotide Targeter 2.0» . Корнелльский университет.

[Comparison-1] Перейти обратно: ^а ^б ^с Саммертон Дж. Э. (2007). «Сравнение морфолино, миРНК и S-ДНК: влияние структуры и механизма действия на нецелевые эффекты и специфичность последовательности». Актуальные темы медицинской химии . 7 (7): 651–60. дои : 10.2174/156802607780487740 . ПМИД 17430206 . S2CID 12241724 .

[RNaseH-2] Саммертон Дж (декабрь 1999 г.). «Морфолино-антисмысловые олигомеры: случай структурного типа, независимого от РНКазы H». Biochimica et Biophysical Acta (BBA) – Структура и экспрессия генов . 1489 (1): 141–58. дои : 10.1016/S0167-4781(99)00150-5 . ПМИД 10807004 .

[Comparison3-3] Перейти обратно: ^а ^б Назявичюс А., Эккер С.С. (октябрь 2000 г.). «Эффективный целевой «нокдаун» гена у рыбок данио». Природная генетика . 26 (2): 216–20. дои : 10.1038/79951 . ПМИД 11017081 . S2CID 21451111 .

[4] Валестедт, Клаас (февраль 1994 г.). «Стратегии антисмысловых олигонуклеотидов в нейрофармакологии». Тенденции Pharmacol Sci . 15 (2): 42–6. дои : 10.1016/0165-6147(94)90107-4 . ПМИД 8165722 .

[Fire_and_Mello-5] Файр А, Сюй С, Монтгомери МК, Костас С.А., Драйвер С.Е., Мелло CC (февраль 1998 г.). «Мощное и специфическое генетическое вмешательство двухцепочечной РНК в Caenorhabditis elegans». Природа . 391 (6669): 806–11. Бибкод : 1998Natur.391..806F . дои : 10.1038/35888 . ПМИД 9486653 . S2CID 4355692 .

[RISC-6] Пратт А.Дж., Макрей И.Дж. (июль 2009 г.). «Комплекс молчания, индуцированный РНК: универсальная машина для подавления генов» . Журнал биологической химии . 284 (27): 17897–901. дои : 10.1074/jbc.R900012200 . ПМК 2709356 . ПМИД 19342379 .

[functional_analysis-7] Фрейзер А.Г., Камат Р.С., Ципперлен П., Мартинес-Кампос М., Зорманн М., Арингер Дж. (ноябрь 2000 г.). «Функциональный геномный анализ хромосомы I C. elegans методом систематической РНК-интерференции». Природа . 408 (6810): 325–30. Бибкод : 2000Natur.408..325F . дои : 10.1038/35042517 . ПМИД 11099033 . S2CID 4373444 .

[Therapeutics-8] Агаард Л., Росси Джей Джей (март 2007 г.). «РНКи-терапия: принципы, перспективы и проблемы» . Обзоры расширенной доставки лекарств . 59 (2–3): 75–86. дои : 10.1016/j.addr.2007.03.005 . ЧВК 1978219 . ПМИД 17449137 .

[RNAi_research-9] Камат Р.С., Арингер Дж. (август 2003 г.). «Полногеномный скрининг РНКи у Caenorhabditis elegans». Методы . 30 (4): 313–21. дои : 10.1016/S1046-2023(03)00050-1 . ПМИД 12828945 .

[10] Гадакзаде С., Мехаил М., Ауде А., Хамди Р., Табризян М. (март 2016 г.). «Маленькие игроки правят жесткой игрой: миРНК в регенерации костей» . Журнал исследований костей и минералов . 31 (3): 475–87. дои : 10.1002/jbmr.2816 . ПМИД 26890411 .

[CRISPR_review-11] Гилберт Л.А., Ларсон М.Х., Морсут Л., Лю З., Брар Г.А., Торрес С.Е., Стерн-Гиноссар Н., Брандман О., Уайтхед Э.Х., Дудна Дж.А., Лим В.А., Вайсман Дж.С., Ци Л.С. (июль 2013 г.). «CRISPR-опосредованная модульная РНК-регулируемая регуляция транскрипции у эукариот» . Клетка . 154 (2): 442–51. дои : 10.1016/j.cell.2013.06.044 . ПМК 3770145 . ПМИД 23849981 .

[human_CRISPR-12] Эсвелт К.М., Мали П., Брафф Дж.Л., Моосбернер М., Яунг С.Дж., генеральный менеджер Черча (ноябрь 2013 г.). «Ортогональные белки Cas9 для регуляции и редактирования генов, управляемых РНК» (PDF) . Природные методы . 10 (11): 1116–21. дои : 10.1038/nmeth.2681 . ПМЦ 3844869 . ПМИД 24076762 .

[CRISPR_bacteria-13] Цзян В., Бикард Д., Кокс Д., Чжан Ф., Марраффини Л.А. (март 2013 г.). «Редактирование бактериальных геномов под контролем РНК с использованием систем CRISPR-Cas» . Природная биотехнология . 31 (3): 233–9. дои : 10.1038/nbt.2508 . ПМЦ 3748948 . ПМИД 23360965 .

[CRISPR_C_elegans-14] Чен С., Фенк Л.А., де Боно М. (ноябрь 2013 г.). «Эффективное редактирование генома Caenorhabditis elegans посредством гомологичной рекомбинации, направленной на CRISPR» . Исследования нуклеиновых кислот . 41 (20): e193. дои : 10.1093/нар/gkt805 . ПМЦ 3814388 . ПМИД 24013562 .

[CRISPR_zebrafish-15] Хисано Ю, Ота С, Кавахара А (январь 2014 г.). «Редактирование генома с использованием искусственных сайт-специфичных нуклеаз у рыбок данио» . Развитие, рост и дифференциация . 56 (1): 26–33. дои : 10.1111/dgd.12094 . ПМИД 24117409 .

[CRISPR_example-16] Геннекин Б., Отте Д.М., Циммер А. (ноябрь 2013 г.). «CRISPR/Cas-индуцированные двухцепочечные разрывы повышают частоту замен генов для гуманизации мышиного гена Cnr2». Связь с биохимическими и биофизическими исследованиями . 441 (4): 815–9. дои : 10.1016/j.bbrc.2013.10.138 . ПМИД 24211574 .

[TALEN_paper-17] Сунь Н., Чжао Х. (июль 2013 г.). «Эффектные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN): высокоэффективный и универсальный инструмент для редактирования генома». Биотехнология и биоинженерия . 110 (7): 1811–21. дои : 10.1002/бит.24890 . ПМИД 23508559 . S2CID 6214542 .

[SB-18] «Клетки с нокдауном аденовирусного гена» . Сирион Биотех. Архивировано из оригинала 9 июля 2013 года . Проверено 17 апреля 2013 г.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]

[13]

[14]

[15]

[16]

[17]

[18]