Агроинфильтрация
 | Этот раздел нуждается в дополнительных цитатах для проверки . ( Май 2016 г. ) |
Агроинфильтрация — это метод, используемый в биологии растений и особенно в последнее время в биотехнологии растений для индукции временной экспрессии в генов растении или изолированных листьях растения или даже в культурах растительных клеток с целью получения желаемого белка . В этом методе суспензию Agrobacterium tumefaciens вводят в лист растения путем прямой инъекции или вакуумной инфильтрации или связывают с растительными клетками, иммобилизованными на пористой подложке (пакеты растительных клеток). [ 1 ] после чего бактерии переносят желаемый ген в растительные клетки посредством переноса Т-ДНК . Основным преимуществом агроинфильтрации по сравнению с более традиционной трансформацией растений является скорость и удобство, хотя урожайность рекомбинантного белка, как правило, также выше и стабильнее.
Первым шагом является введение интересующего гена в штамм Agrobacterium tumefaciens . Впоследствии штамм выращивают в жидкой культуре , полученные бактерии промывают и суспендируют в подходящем буферном растворе . Для инъекции этот раствор затем помещают в шприц (без иглы). Кончик шприца прижимается к нижней стороне листа , одновременно оказывая легкое противодавление на другую сторону листа. Затем суспензию Agrobacterium вводят в воздушное пространство внутри листа через устьица или иногда через крошечный надрез, сделанный на нижней стороне листа.
Вакуумная инфильтрация – еще один способ внедрения агробактерий глубоко в ткани растения. В этой процедуре листовые диски, листья или целые растения погружают в химический стакан, содержащий раствор, и химический стакан помещают в вакуумную камеру. Затем применяется вакуум, вытесняющий воздух из межклеточных пространств листьев через устьица. При сбросе вакуума разница давлений выталкивает взвесь «Агробактерий» в листья через устьица в ткань мезофилла . Это может привести к тому, что почти все клетки любого листа будут контактировать с бактериями.
Попав внутрь листа, Agrobacterium остается в межклеточном пространстве и переносит интересующий ген как часть Т-ДНК, полученной из Ti-плазмиды, в большом количестве копий в растительные клетки. Перенос генов происходит, когда индуцируются растительные сигналы и устанавливается физический контакт между растительными клетками и бактериями. Бактерии создают механизм, который прорывает дыру и переносит новую цепь Т-ДНК в растительную клетку. Т-ДНК перемещается в ядро растения и начинает интегрироваться в хромосому растения. Затем ген временно экспрессируется посредством синтеза РНК из соответствующих последовательностей промотора во всех трансфицированных клетках (селекция на стабильную интеграцию не проводится). Растение можно отслеживать на предмет возможного влияния на фенотип , помещать в экспериментальные условия или собирать и использовать для белка очистки интересующего . Этим методом можно обрабатывать многие виды растений, но наиболее распространены Nicotiana benthamiana и реже Nicotiana tabacum. .
Временная экспрессия в пакетах культивируемых растительных клеток — это новая процедура, недавно запатентованная Институтом Фраунгофера IVV, Германия. [ 2 ] Для этого метода суспензионные культивированные клетки табака (например, клеточные линии NT1 или BY2 Nicotiana tabacum ) иммобилизуют путем фильтрации на пористой подложке с образованием хорошо аэрируемого клеточного пакета, затем инкубируют с рекомбинантными Agrobacterium в течение времени, чтобы дать Т- Перенос ДНК перед повторной фильтрацией для удаления излишков бактерий и жидкости. Инкубация клеточного пакета во влажной среде в течение периода времени до нескольких дней обеспечивает временную экспрессию белка. Секретируемые белки можно вымыть из клеточной упаковки путем применения буфера и дальнейшей фильтрации.
Глушители глушения при агроинфильтрации
[ редактировать ]
Довольно часто агробактерию, несущую представляющую интерес конструкцию, фильтруют совместно с другой агробактерией, несущей ген белка-супрессора молчания, например тот, который кодирует белок p19 из патогенного для растений вируса кустистости томатов (TBSV) или белок NSs. [ 3 ] вирус пятнистого увядания томата (TSWV). TBSV был впервые обнаружен в 1935 году у томатов и приводит к задержке роста растений и деформированию плодов. TSWV был обнаружен в томатах в Австралии в 1915 году и в течение многих лет был единственным представителем того, что сейчас известно как род Tospovirus , семейство Bunyaviridae .
Чтобы защитить себя от вирусов и других патогенов, которые внедряют чужеродные нуклеиновые кислоты в свои клетки, растения разработали систему посттранскрипционного молчания генов (PTGS), при которой небольшие интерферирующие РНК производятся из двухцепочечной РНК для создания последовательности. специфический путь деградации, который эффективно подавляет чужеродные гены. [ 4 ] [ 5 ] Многие вирусы растений разработали механизмы, которые противодействуют PTGS-системам растений путем развития белков, таких как p19 и NS, которые мешают PTGS-пути на разных уровнях. [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ]
Хотя неясно, как именно p19 подавляет молчание РНК, исследования показали, что временно экспрессируемые белки в листьях Nicotiana benthamiana дают в 50 раз больший выход при совместной фильтрации с TBSV p19. [ 9 ] [ 10 ]
Было показано, что TSWV и другие белки NS тосповируса эффективны в качестве супрессоров как местного, так и системного молчания. [ 11 ] и может быть полезной альтернативой p19, если последний оказался неэффективным. В других исследованиях было показано, что p19 из вируса крапчатой морщинистости артишока оказывает аналогичный, хотя и более слабый, эффект, что и p19 TBSV. [ 12 ]
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ |url= https://www.researchgate.net/project/Plant-cell-pack-aka-cookie-technology
- ^ «Способ получения и выращивания пакета растительных клеток» .
- ^ Такеда, А; Сугияма, К; Нагано, Х; Мори, М; Кайдо, М; Мизе, К; Цуда, С; Окуно, Т (2002). «Идентификация нового супрессора молчания РНК, белка NSs вируса пятнистого увядания томата» . ФЭБС Летт . 532 (1–2): 75–9. дои : 10.1016/s0014-5793(02)03632-3 . ПМИД 12459466 .
- ^ Хаммонд, Скотт М.; Коди, Эми А.; Хэннон, Грегори Дж. (февраль 2001 г.). «Посттранскрипционное молчание генов с помощью двухцепочечной РНК». Обзоры природы Генетика . 2 (2): 110–119. дои : 10.1038/35052556 . ПМИД 11253050 . S2CID 2864720 .
- ^ Йохансен, Лиза К.; Кэррингтон, Джеймс К. (1 июля 2001 г.). «Замалчивание на месте. Индукция и подавление замалчивания РНК в системе временной экспрессии, опосредованной агробактериями» . Физиология растений . 126 (3): 930–938. дои : 10.1104/стр.126.3.930 . ISSN 1532-2548 . ПМК 1540124 . ПМИД 11457942 .
- ^ Анандалакшми, Радхамани; Прусс, Гейл Дж.; Гэ, Синь; Маратхе, Раджендра; Мэллори, Эллисон К.; Смит, Трентон Х.; Вэнс, Вики Б. (27 октября 1998 г.). «Вирусный супрессор молчания генов у растений» . Труды Национальной академии наук . 95 (22): 13079–13084. Бибкод : 1998PNAS...9513079A . дои : 10.1073/pnas.95.22.13079 . ISSN 0027-8424 . ПМК 23715 . ПМИД 9789044 .
- ^ Кашау, Кристин Д.; Кэррингтон, Джеймс К. (13 ноября 1998 г.). «Стратегия контрзащиты от растительных вирусов» . Клетка . 95 (4): 461–470. дои : 10.1016/S0092-8674(00)81614-1 . ISSN 0092-8674 . ПМИД 9827799 .
- ^ Вуанне, Оливье (1 августа 2001 г.). «Замалчивание РНК как иммунная система растений против вирусов». Тенденции в генетике . 17 (8): 449–459. дои : 10.1016/S0168-9525(01)02367-8 . ISSN 0168-9525 . ПМИД 11485817 .
- ^ Вуанне, Оливье; Ривас, Сусана; Местре, Пере; Баулкомб, Дэвид (01 марта 2003 г.). «Отменено: улучшенная система временной экспрессии в растениях, основанная на подавлении молчания генов белком p19 вируса кустистости томатов» . Заводской журнал . 33 (5): 949–956. дои : 10.1046/j.1365-313X.2003.01676.x . ISSN 1365-313X . ПМИД 12609035 . S2CID 2412771 . (Отозвано, см. дои : 10.1111/tpj.13066 , PMID 27170951 , Часы втягивания )
- ^ «Опровержение: «Усиленная система временной экспрессии в растениях, основанная на подавлении молчания генов белком p19 вируса кустистости томата» » . Заводской журнал . 84 (4): 846. 01.11.2015. дои : 10.1111/tpj.13066 . ISSN 1365-313X . ПМИД 27170951 .
- ^ Хедиль, М; Стеркен, МГ; Раунд, Д; Лохуис, Д; Кормелинк, Р. (2015). «Анализ белков NSs тосповируса в подавлении системного молчания» . ПЛОС ОДИН . 10 (8): e0134517. Бибкод : 2015PLoSO..1034517H . дои : 10.1371/journal.pone.0134517 . ПМЦ 4537313 . ПМИД 26275304 .
- ^ Ломбарди, Рафаэле; Чирчелли, Патриция; Виллани, Мария; Буриани, Джампаоло; Нарди, Лука; Коппола, Валентина; Уайт, Линда; Добро пожаловать, Евгений; Донини, Марчелло (20 ноября 2009 г.). «Высокоуровневая транзиторная экспрессия Nef ВИЧ-1 у Nicotiana benthamiana с использованием белка-супрессора, подавляющего молчание гена P19, из-за орфографической ошибки артишока Mottled Crinckle в названии Virus» . БМК Биотехнология . 9 (1): 96. дои : 10.1186/1472-6750-9-96 . ПМЦ 2785776 . ПМИД 19930574 .