Библиотека (биология)

В молекулярной биологии библиотека — это совокупность фрагментов генетического материала , которые хранятся и распространяются в популяции микробов посредством процесса молекулярного клонирования . Существуют различные типы библиотек ДНК, включая библиотеки кДНК (сформированные из обратной транскрипции РНК ), геномные библиотеки (сформированные из геномной ДНК) и рандомизированные мутантные библиотеки (сформированные путем синтеза генов de novo, в которые включены альтернативные нуклеотиды или кодоны). Технология библиотек ДНК является основой современной молекулярной биологии , генной инженерии и белковой инженерии , и применение этих библиотек зависит от источника исходных фрагментов ДНК. Существуют различия в векторах клонирования и методах, используемых при подготовке библиотеки, но, как правило, каждый фрагмент ДНК уникально вставляется в вектор клонирования, а пул рекомбинантных молекул ДНК затем переносится в популяцию бактерий ( библиотеку бактериальных искусственных хромосом или BAC). ) или дрожжи такие, что каждый организм содержит в среднем одну конструкцию (вектор + вставка). По мере выращивания популяции организмов в культуре молекулы ДНК, содержащиеся в них, копируются и размножаются (таким образом, «клонируются»).

Терминология

Термин «библиотека» может относиться к популяции организмов, каждый из которых несет молекулу ДНК, встроенную в вектор клонирования, или, альтернативно, к коллекции всех клонированных векторных молекул.

библиотеки кДНК

Библиотека кДНК представляет собой образец мРНК , очищенной из определенного источника (либо коллекции клеток, определенной ткани или всего организма), который был преобразован обратно в матрицу ДНК с помощью фермента обратной транскриптазы . Таким образом, он представляет собой гены, которые активно транскрибировались в этом конкретном источнике в физиологических условиях, условиях развития или окружающей среды, существовавших на момент очистки мРНК. Библиотеки кДНК могут быть созданы с использованием методов, способствующих созданию «полноразмерных» клонов, или в условиях, позволяющих генерировать более короткие фрагменты, используемые для идентификации « меток экспрессируемой последовательности ».

Библиотеки кДНК полезны в обратной генетике, но они представляют лишь очень небольшую (менее 1%) часть общего генома данного организма.

Приложения библиотек кДНК включают:

Открытие новых генов
Клонирование полноразмерных молекул кДНК для in vitro исследования функции генов
Изучение репертуара мРНК, экспрессируемых в разных клетках или тканях.
Изучение альтернативного сплайсинга в разных клетках или тканях.

Геномные библиотеки

Геномная библиотека — это набор клонов, которые вместе представляют весь геном данного организма. Количество клонов, составляющих геномную библиотеку, зависит от (1) размера рассматриваемого генома и (2) размера вставки, допускаемого конкретной векторной системой клонирования . Для большинства практических целей тканевой источник геномной ДНК неважен, поскольку каждая клетка организма содержит практически идентичную ДНК (за некоторыми исключениями).

Приложения геномных библиотек включают:

Определение полной последовательности генома данного организма (см. геномный проект )
Служит источником геномной последовательности для создания трансгенных животных с помощью генной инженерии.
Исследование функции регуляторных последовательностей in vitro.
Исследование генетических мутаций в раковых тканях

Библиотеки синтетических мутантов

В отличие от типов библиотек, описанных выше, существует множество искусственных методов создания библиотек вариантов генов. ^[1] Вариации по всему гену могут быть внесены случайным образом с помощью ПЦР, подверженной ошибкам , ^[2] Перетасовка ДНК для рекомбинации частей схожих генов вместе, ^[3] или методы на основе транспозонов для введения инделей . ^[4]Альтернативно, мутации могут быть направлены на определенные кодоны во время de novo синтеза или насыщающего мутагенеза для создания одного или нескольких точковых мутантов гена контролируемым способом. ^[5] В результате образуется смесь двухцепочечных молекул ДНК, которые представляют собой варианты исходного гена.

Экспрессированные . белки из этих библиотек затем можно подвергнуть скринингу на наличие вариантов, которые проявляют благоприятные свойства (например, стабильность, аффинность связывания или ферментативную активность) Это можно повторять в циклах создания вариантов гена и скрининга продуктов экспрессии в процессе направленной эволюции . ^[1]

Обзор методов подготовки библиотеки кДНК

экстракция ДНК

При создании библиотеки мРНК (т.е. с клонами кДНК) существует несколько возможных протоколов выделения полноразмерной мРНК. Для извлечения ДНК из библиотек геномной ДНК (также известной как гДНК) может быть полезен мини-препарат ДНК.

Подготовка вставки

Библиотеки кДНК требуют осторожности, чтобы гарантировать, что полноразмерные клоны мРНК будут захвачены в виде кДНК (которые позже будут вставлены в векторы). По этой причине было разработано несколько протоколов для оптимизации синтеза 1-й цепи кДНК и 2-й цепи кДНК, а также для повышения вероятности направленного клонирования в вектор.

Фрагменты гДНК получают из экстрагированной гДНК с использованием неспецифических ферментов рестрикции с частыми обрезками.

Векторы

Интересующие нуклеотидные последовательности сохраняются в виде вставок в плазмиду или геном бактериофага, который использовался для заражения бактериальных клеток.

Векторы чаще всего размножаются в бактериальных клетках, но при использовании YAC (дрожжевой искусственной хромосомы) можно использовать дрожжевые клетки. Векторы также можно размножать в вирусах, но это может занять много времени и утомительно. Однако высокая эффективность трансфекции, достигаемая с помощью вирусов (часто фагов), делает их полезными для упаковки вектора (с лигированной вставкой) и последующего введения его в бактериальную (или дрожжевую) клетку.

Дополнительно для библиотек кДНК разработана система с использованием фага Lambda Zap II, ExAssist и 2 видов E. coli. Вместо этого также можно использовать систему Cre-Lox, использующую сайты loxP и экспрессию фермента рекомбиназы in vivo. Это примеры систем иссечения in vivo. Иссечение in vitro включает субклонирование, часто с использованием традиционных ферментов рестрикции и стратегий клонирования. Иссечение in vitro может занять больше времени и потребовать больше «практической» работы, чем системы иссечения in vivo. В любом случае системы позволяют перемещать вектор из фага в живую клетку, где вектор может реплицироваться и размножаться до тех пор, пока библиотека не будет использована.

Использование библиотек

Это включает в себя «скрининг» интересующих последовательностей. Существует несколько возможных методов достижения этой цели.

Ссылки

^ Jump up to: ^а ^б Ваджапи, Нарендра; Лю, Алекс Ю.; Форлони, Маттео (01 марта 2018 г.). «Случайный мутагенез с использованием склонных к ошибкам ДНК-полимераз». Протоколы Колд-Спринг-Харбора . 2018 (3): pdb.prot097741. дои : 10.1101/pdb.prot097741 . ISSN 1940-3402 . ПМИД 29496818 .
^ Маккаллум, Элизабет О.; Уильямс, Берия, Арканзас; Чжан, Джинглей; Чапут, Джон К. (2010), Браман, Джефф (ред.), «Случайный мутагенез с помощью ПЦР, склонной к ошибкам», Протоколы мутагенеза in vitro: третье издание , Методы молекулярной биологии, том. 634, Humana Press, стр. 103–109, номер документа : 10.1007/978-1-60761-652-8_7 , ISBN. 9781607616528 , PMID 20676978
^ Крамери А., Райлард С.А., Бермудес Э., Стеммер В.П. (январь 1998 г.). «Перетасовка ДНК семейства генов разных видов ускоряет направленную эволюцию». Природа . 391 (6664): 288–91. Бибкод : 1998Natur.391..288C . дои : 10.1038/34663 . ПМИД 9440693 . S2CID 4352696 .
^ Джонс Д.Д. (май 2005 г.). «Удаление триплетных нуклеотидов в случайных положениях в гене-мишени: толерантность бета-лактамазы TEM-1 к делеции аминокислоты» . Исследования нуклеиновых кислот . 33 (9): е80. дои : 10.1093/nar/gni077 . ПМК 1129029 . ПМИД 15897323 .
^ Ван, Тянь-Вэнь; Чжу, Ху; Ма, Син-Юань; Чжан, Тин; Ма, Ю-Шу; Вэй, Дун-Чжи (1 сентября 2006 г.). «Создание мутантной библиотеки в направленной молекулярной эволюции». Молекулярная биотехнология . 34 (1): 55–68. дои : 10.1385/МБ:34:1:55 . ISSN 1559-0305 . ПМИД 16943572 . S2CID 44393645 .

Внешние ссылки

Ресурсы библиотеки о
Генные библиотеки

[:0-1] Jump up to: ^а ^б Ваджапи, Нарендра; Лю, Алекс Ю.; Форлони, Маттео (01 марта 2018 г.). «Случайный мутагенез с использованием склонных к ошибкам ДНК-полимераз». Протоколы Колд-Спринг-Харбора . 2018 (3): pdb.prot097741. дои : 10.1101/pdb.prot097741 . ISSN 1940-3402 . ПМИД 29496818 .

[2] Маккаллум, Элизабет О.; Уильямс, Берия, Арканзас; Чжан, Джинглей; Чапут, Джон К. (2010), Браман, Джефф (ред.), «Случайный мутагенез с помощью ПЦР, склонной к ошибкам», Протоколы мутагенеза in vitro: третье издание , Методы молекулярной биологии, том. 634, Humana Press, стр. 103–109, номер документа : 10.1007/978-1-60761-652-8_7 , ISBN. 9781607616528 , PMID 20676978

[3] Крамери А., Райлард С.А., Бермудес Э., Стеммер В.П. (январь 1998 г.). «Перетасовка ДНК семейства генов разных видов ускоряет направленную эволюцию». Природа . 391 (6664): 288–91. Бибкод : 1998Natur.391..288C . дои : 10.1038/34663 . ПМИД 9440693 . S2CID 4352696 .

[4] Джонс Д.Д. (май 2005 г.). «Удаление триплетных нуклеотидов в случайных положениях в гене-мишени: толерантность бета-лактамазы TEM-1 к делеции аминокислоты» . Исследования нуклеиновых кислот . 33 (9): е80. дои : 10.1093/nar/gni077 . ПМК 1129029 . ПМИД 15897323 .

[5] Ван, Тянь-Вэнь; Чжу, Ху; Ма, Син-Юань; Чжан, Тин; Ма, Ю-Шу; Вэй, Дун-Чжи (1 сентября 2006 г.). «Создание мутантной библиотеки в направленной молекулярной эволюции». Молекулярная биотехнология . 34 (1): 55–68. дои : 10.1385/МБ:34:1:55 . ISSN 1559-0305 . ПМИД 16943572 . S2CID 44393645 .

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]