Насыщающий мутагенез
Сайт-насыщенный мутагенез (SSM) , или просто сайт-насыщение , представляет собой метод случайного мутагенеза, используемый в белковой инженерии , при котором один кодон или набор кодонов заменяется всеми возможными аминокислотами в соответствующем положении. [1] Существует множество вариантов метода насыщения сайтов: от насыщения парных сайтов (насыщение двух позиций в каждом мутанте в библиотеке) до насыщения сайтов сканирования (выполнение насыщения сайтов в каждом сайте белка, в результате чего получается библиотека определенного размера [20]). (количество остатков в белке)], который содержит все возможные точечные мутанты белка).
Метод
[ редактировать ]
Насыщающий мутагенез обычно достигается с помощью сайт-направленного мутагенеза ПЦР со рандомизированным кодоном в праймерах (например, SeSaM ). [2] или путем искусственного синтеза генов со смесью синтезируемых нуклеотидов , используемых в рандомизированных кодонах. [3]
Для кодирования наборов аминокислот можно использовать различные вырожденные кодоны. [1] Поскольку некоторые аминокислоты кодируются большим количеством кодонов, чем другие, точное соотношение аминокислот не может быть равным. Кроме того, обычно используют вырожденные кодоны, которые минимизируют количество стоп-кодонов (что обычно нежелательно). Следовательно, полностью рандомизированный NNN не идеален, и используются альтернативные, более ограниченные вырожденные кодоны. «NNK» и «NNS» кодируют все 20 аминокислот, но в 3% случаев по-прежнему кодируют стоп-кодон. Альтернативные кодоны, такие как «NDT», «DBK», полностью избегают стоп-кодонов и кодируют минимальный набор аминокислот, который по-прежнему охватывает все основные биофизические типы (анионные, катионные, алифатические гидрофобные, ароматические гидрофобные, гидрофильные, малые). [1] В случае, когда нет ограничений на использование только одного вырожденного кодона, можно значительно уменьшить смещение. [4] [5] Было разработано несколько вычислительных инструментов, обеспечивающих высокий уровень контроля над вырожденными кодонами и соответствующими им аминокислотами. [6] [7] [8]
| Вырожденный кодон | Количество кодонов | Количество аминокислот | Количество остановок | Аминокислоты, кодируемые |
|---|---|---|---|---|
| ННН | 64 | 20 | 3 | Все 20 |
| ННК/ННС | 32 | 20 | 1 | Все 20 |
| неразрушающий контроль | 12 | 12 | 0 | RNDCGHILFSEVEN |
| БРК | 18 | 12 | 0 | АРКГИЛМФСТВВ |
| НЗТ | 8 | 8 | 0 | РНДЦГСИ |
Приложения
[ редактировать ]Насыщающий мутагенез обычно используется для создания вариантов для направленной эволюции . [9] [10]
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с Ритц, Монтана; Карбалейра Джей Ди (2007). «Итеративный насыщающий мутагенез (ISM) для быстрой направленной эволюции функциональных ферментов». Протоколы природы . 2 (4): 891–903. дои : 10.1038/nprot.2007.72 . PMID 17446890 . S2CID 37361631 .
- ^ Чжэн, Лэй; Бауманн, Ульрих; Реймонд, Жан-Луи (15 июля 2004 г.). «Эффективный одноэтапный протокол сайт-направленного и сайт-насыщенного мутагенеза» . Исследования нуклеиновых кислот . 32 (14): е115. дои : 10.1093/нар/gnh110 . ISSN 0305-1048 . ПМК 514394 . ПМИД 15304544 .
- ^ Ритц, Манфред Т.; Прасад, Шринатх; Карбалейра, Хосе Д.; Гумуля, Йозефина; Бокола, Марко (07 июля 2010 г.). «Итеративный насыщающий мутагенез ускоряет лабораторную эволюцию стереоселективности ферментов: строгое сравнение с традиционными методами». Журнал Американского химического общества . 132 (26): 9144–9152. дои : 10.1021/ja1030479 . ISSN 0002-7863 . ПМИД 20536132 .
- ^ Килле, Сабрина; Асеведо-Роча, Карлос Г.; Парра, Лорето П.; Чжан, Чжи-Ган; Опперман, Дидерик Дж.; Ритц, Манфред Т.; Асеведо, Хуан Пабло (15 февраля 2013 г.). «Уменьшение избыточности кодонов и усилия по скринингу комбинаторных белковых библиотек, созданных с помощью насыщающего мутагенеза». ACS Синтетическая биология . 2 (2): 83–92. дои : 10.1021/sb300037w . ПМИД 23656371 .
- ^ Тан, Ликсия; Ван, Сюн; Ру, Бэйбэй; Сунь, Хэнфэй; Хуан, Цзянь; Гао, Хуэй (июнь 2014 г.). «MDC-Analyzer: новый инструмент для создания вырожденных праймеров для создания библиотек интеллектуального мутагенеза со смежными сайтами» . БиоТехники . 56 (6): 301–302, 304, 306–308, пассим. дои : 10.2144/000114177 . ISSN 1940-9818 . ПМИД 24924390 .
- ^ Халвег-Эдвардс, Андреа Л.; Сосны, Гур; Винклер, Джеймс Д.; Сосны, Асаф; Гилл, Райан Т. (16 сентября 2016 г.). «Веб-интерфейс для сжатия кодонов». ACS Синтетическая биология . 5 (9): 1021–1023. doi : 10.1021/acsynbio.6b00026 . ISSN 2161-5063 . ПМИД 27169595 .
- ^ Энгквист, Мартин К.М.; Нильсен, Йенс (30 апреля 2015 г.). «ANT: Программное обеспечение для генерации и оценки вырожденных кодонов для природных и расширенных генетических кодов». ACS Синтетическая биология . 4 (8): 935–938. doi : 10.1021/acsynbio.5b00018 . ПМИД 25901796 .
- ^ Келл, Дуглас Б.; Дэй, Филип Дж.; Брейтлинг, Райнер; Грин, Люси; Каррин, Эндрю; Суэйнстон, Нил (10 июля 2017 г.). «CodonGenie: оптимизированные инструменты дизайна неоднозначных кодонов» . PeerJ Информатика . 3 : е120. doi : 10.7717/peerj-cs.120 . ISSN 2376-5992 .
- ^ Чика, Роберт А.; и др. (2005). «Полурациональные подходы к конструированию активности ферментов: сочетание преимуществ направленной эволюции и рационального дизайна». Современное мнение в области биотехнологии . 16 (4): 378–384. doi : 10.1016/j.copbio.2005.06.004 . ПМИД 15994074 .
- ^ Шиванге, Амол V; Мариенхаген, Ян; Мундхада, Хеманшу; Шенк, Александр; Шванеберг, Ульрих (1 февраля 2009 г.). «Достижения в создании функционального разнообразия для направленной эволюции белков». Современное мнение в области химической биологии . Биокатализ и биотрансформация/Бионеорганическая химия. 13 (1): 19–25. дои : 10.1016/j.cbpa.2009.01.019 . ПМИД 19261539 .