Генный нокаут
В молекулярном клонировании и биологии ( нокаут гена аббревиатура: KI ) относится к методу генной инженерии , который включает замену один к одному информации о последовательности ДНК в генетическом локусе или вставку информации о последовательности, не найденной в этом локусе. . [1] Обычно это делается на мышах, поскольку технология этого процесса более совершенна и существует высокая степень общей сложности последовательностей между мышами и людьми. [2] Разница между технологией «нок-ин» и традиционными трансгенными методами заключается в том, что «нок-ин» предполагает вставку гена в определенный локус и, таким образом, является «целевой» вставкой. Это противоположность нокауту генов .
Обычно технология «нок-ин» используется для создания моделей заболеваний. Это метод, с помощью которого научные исследователи могут изучать функцию регуляторного механизма (например, промоторов ), который управляет экспрессией заменяемого природного гена. Это достигается путем наблюдения за новым фенотипом рассматриваемого организма. В этом случае используются BAC , и YAC чтобы можно было передавать большие фрагменты.
Техника
[ редактировать ]Генный нокаут возник как небольшая модификация оригинальной техники нокаута, разработанной Мартином Эвансом , Оливером Смитисом и Марио Капеччи . Традиционно методы «нок-ин» полагались на гомологичную рекомбинацию для запуска целевой замены гена, хотя и другие методы, использующие транспозон -опосредованную систему для вставки целевого гена. были разработаны [3] использование фланкирующих сайтов loxP , которые вырезаются при экспрессии рекомбиназы Cre Примером этого является с генными векторами. Эмбриональные стволовые клетки с интересующей модификацией затем имплантируют в жизнеспособную бластоцисту , которая вырастет в зрелую химерную мышь с некоторыми клетками, имеющими исходную генетическую информацию о клетках бластоцисты, и другими клетками, имеющими модификации, введенные в эмбриональные стволовые клетки. Последующее потомство химерной мыши будет иметь нокаутированный ген. [4]
Нокаут генов впервые позволил провести основанные на гипотезах исследования модификаций генов и возникающих в результате фенотипов. Например, мутации в гене p53 человека могут быть вызваны воздействием бензо(а)пирена (BaP), а мутированная копия гена p53 может быть вставлена в геном мыши. Опухоли легких , обнаруженные у нокаутированных мышей, подтверждают гипотезу о канцерогенности BaP . [5] Более поздние разработки в области техники «нок-ин» позволили свиньям встроить ген зеленого флуоресцентного белка с помощью системы CRISPR/Cas9 , что позволяет осуществлять гораздо более точные и успешные вставки гена. [6] Скорость нокаутирования генов, опосредованного CRISPR/Cas9, также позволяет биаллельные модификации некоторых генов и наблюдать фенотип у мышей в одном поколении, что является беспрецедентным периодом времени. генерировать [7]
Против нокаута гена
[ редактировать ]Технология нокаута отличается от технологии нокаута тем, что технология нокаута направлена либо на удаление части последовательности ДНК, либо на вставку нерелевантной информации о последовательности ДНК, чтобы нарушить экспрессию определенного генетического локуса. С другой стороны, технология генного нокаута изменяет интересующий генетический локус посредством замены один к одному информации о последовательности ДНК или путем добавления информации о последовательности, которая не обнаружена в указанном генетическом локусе. Таким образом, нокаут гена можно рассматривать как мутацию с приобретением функции , а нокаут гена — как мутацию с потерей функции , но нокаут гена может также включать замену функционального локуса гена на мутантный фенотип, который приводит к некоторой потере функции. [8]
Возможные применения
[ редактировать ]Благодаря успеху методов нокаутирования генов, можно предвидеть множество клинических применений. Уже было показано , что введение мышам участков человеческого гена иммуноглобулина позволяет им производить гуманизированные антитела, которые являются терапевтически полезными. [9] Должно быть возможно модифицировать стволовые клетки у людей для восстановления целевой функции гена в определенных тканях, например, возможно, корректируя мутантный ген гамма-цепи рецептора IL-2 в гемопоэтических стволовых клетках для восстановления развития лимфоцитов у людей с Х-сцепленной тяжелой формой заболевания. комбинированный иммунодефицит . [4]
Ограничения
[ редактировать ]Хотя технология генного нокаута оказалась мощной техникой для создания моделей заболеваний человека и понимания белков in vivo , все еще существуют многочисленные ограничения. Многие из них являются общими с ограничениями технологии нокаута. Во-первых, комбинации нокаутированных генов приводят к растущей сложности взаимодействий встроенных генов и их продуктов с другими участками генома и, следовательно, могут привести к большему количеству побочных эффектов и труднообъяснимых фенотипов . Кроме того, только несколько локусов, таких как локус ROSA26, охарактеризованы достаточно хорошо, и их можно использовать для условного нокайна генов; создание комбинаций репортера и трансгенов в одном и том же локусе проблематично. Самый большой недостаток использования нокаутированного гена для создания модели заболевания человека заключается в том, что физиология мыши не идентична человеческой, а человеческие ортологи белков, экспрессируемых у мышей, часто не полностью отражают роль гена в патологии человека. [10] Это можно увидеть на мышах, рожденных с мутацией фиброза ΔF508 в гене CFTR , которая составляет более 70% мутаций в этом гене для человеческой популяции и приводит к муковисцидозу . Хотя мыши ΔF508 CF действительно демонстрируют дефекты обработки, характерные для человеческой мутации, они не демонстрируют легочных патофизиологических изменений, наблюдаемых у людей, и практически не несут легочного фенотипа. [11] Такие проблемы можно было бы решить за счет использования различных моделей животных, а модели свиней (легкие свиньи имеют много биохимических и физиологических сходств с легкими человека) были созданы в попытке лучше объяснить активность мутации ΔF508. [12]
См. также
[ редактировать ]- Джин нокаут
- Генная инженерия
- Генетическая рекомбинация
- Молекулярное клонирование
- Плазмида
- Вектор (молекулярная биология)
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Гибсон, Грег (2009). Учебник по геномной науке, 3-е изд . Сандерленд, Массачусетс: Синауэр. стр. 301–302. ISBN 978-0-87893-236-8 .
- ^ Консорциум по секвенированию генома мыши; Уотерстон, Роберт Х.; Линдблад-То, Керстин; Бирни, Юэн; Роджерс, Джейн; Абриль, Хосеп Ф.; Агарвал, Панкадж; Агарвала, Рича; Эйнскоу, Рэйчел (5 декабря 2002 г.). «Первичное секвенирование и сравнительный анализ генома мыши» . Природа . 420 (6915): 520–562. Бибкод : 2002Natur.420..520W . дои : 10.1038/nature01262 . ISSN 0028-0836 . ПМИД 12466850 .
- ^ Вестфаль, Швейцария; Ледер, П. (1 июля 1997 г.). «Сгенерированные транспозонами «нокаутирующие» и «нокинативные» конструкции, нацеленные на гены, для использования на мышах» . Современная биология . 7 (7): 530–533. дои : 10.1016/s0960-9822(06)00224-7 . ISSN 0960-9822 . ПМИД 9210379 .
- ^ Jump up to: а б Манис, Джон П. (13 декабря 2007 г.). «Нокаут, нокаут, нокаут – генетически манипулированные мыши и Нобелевская премия». Медицинский журнал Новой Англии . 357 (24): 2426–2429. дои : 10.1056/NEJMp0707712 . ISSN 1533-4406 . ПМИД 18077807 .
- ^ Лю, Жипей; Мюльбауэр, Карл-Рудольф; Шмайзер, Хайнц Х.; Хергенхан, Манфред; Белхаразем, Джеда; Холлштейн, Моника К. (1 апреля 2005 г.). «Мутации p53 в мышиных фибробластах человека, подвергшихся воздействию бензо(а)пирена, коррелируют с мутациями p53 в опухолях легких человека». Исследования рака . 65 (7): 2583–2587. дои : 10.1158/0008-5472.CAN-04-3675 . ISSN 0008-5472 . ПМИД 15805253 .
- ^ Жуань, Цзиньсюэ; Сюй, Куй; Ву, Цзинлян; Лю, Чжиго; Ян, Шулин (18 сентября 2015 г.) . опосредованный трансгенный нокин в локусе H11 у свиней» . Scientific Reports . 5 : 14253. Bibcode : ...514253R . doi : 10.1038/srep14253 . PMC 4585612. . PMID 26381350 2015NatSR
- ^ Ван, Яньлян; Ли, Джунхун; Сян, Цзиньчжу; Вэнь, Бинцян; Му, Хайюань; Чжан, Вэй; Хан, Цзянюн (10 декабря 2015 г.). «Высокоэффективное создание мышей с нокаутом двуаллельного репортерного гена посредством CRISPR-опосредованного редактирования генома ЭСК» . Белок и клетка . 7 (2): 152–156. дои : 10.1007/s13238-015-0228-3 . ISSN 1674-800X . ПМЦ 4742388 . ПМИД 26661644 .
- ^ Дойл, Альфред; МакГарри, Майкл П.; Ли, Нэнси А.; Ли, Джеймс Дж. (1 апреля 2012 г.). «Создание трансгенных и моделей заболеваний человека с нокаутом генов/ноккин-мышей» . Трансгенные исследования . 21 (2): 327–349. дои : 10.1007/s11248-011-9537-3 . ISSN 0962-8819 . ПМК 3516403 . ПМИД 21800101 .
- ^ Бенатуил, Лоренцо; Кэй, Джоэл; Кретин, Натали; Годвин, Джонатан Г.; Кариаппа, Аннайя; Пиллаи, Шив; Якомини, Джон (15 марта 2008 г.). «Мыши с нокаутом Ig, продуцирующие антиуглеводные антитела: прорыв В-клеток, производящих антисамостоятельные антитела с низким сродством» . Журнал иммунологии . 180 (6): 3839–3848. дои : 10.4049/jimmunol.180.6.3839 . ISSN 0022-1767 . ПМИД 18322191 .
- ^ Телькамп, Фредерик; Бенаду, Фарида; Бремер, Йерун; Гнарра, Мария; Кнювер, Яна; Шаффенрат, Сандра; Форхаген, Сюзанна (1 декабря 2014 г.). «Технология трансгенных мышей в биологии кожи: поколение нокаутных мышей» . Журнал исследовательской дерматологии . 134 (12): 1–3. дои : 10.1038/jid.2014.434 . ISSN 1523-1747 . ПМИД 25381772 .
- ^ Грабб, Барбара Р.; Баучер, Ричард К. (1 января 1999 г.). «Патофизиология генно-ориентированных мышиных моделей муковисцидоза». Физиологические обзоры . 79 (1): С193–С214. дои : 10.1152/physrev.1999.79.1.S193 . ISSN 0031-9333 . ПМИД 9922382 .
- ^ Роджерс, Кристофер С.; Хао, Яньхун; Рохлина Татьяна; Сэмюэл, Мелисса; Штольц, Дэвид А.; Ли, Юхонг; Петрова, Елена; Вермеер, Дэниел В.; Кабель, Аманда К. (1 апреля 2008 г.). «Производство гетерозиготных свиней по CFTR-null и CFTR-DeltaF508 путем нацеливания на ген, опосредованного аденоассоциированным вирусом, и переноса ядра соматических клеток» . Журнал клинических исследований . 118 (4): 1571–1577. дои : 10.1172/JCI34773 . ISSN 0021-9738 . ПМК 2265103 . ПМИД 18324337 .
Внешние ссылки
[ редактировать ]- Генетические методы, методики и протоколы
- Институт Коха интегративных исследований рака при Массачусетском технологическом институте: нокауты и нокауты
- Программное обеспечение для исследовательских сетей UMass Profiles: Gene Knock-In Techniques - программный инструмент для исследовательских сетей и интеллектуального анализа
- http://www.transgenic.co.jp/en/products/mice-service/modified_mouse/knockin.php – описывает процесс создания инсерционных векторов и разведения мышей.