Jump to content

Генный нокаут

В молекулярном клонировании и биологии ( нокаут гена аббревиатура: KI ) относится к методу генной инженерии , который включает замену один к одному информации о последовательности ДНК в генетическом локусе или вставку информации о последовательности, не найденной в этом локусе. . [1] Обычно это делается на мышах, поскольку технология этого процесса более совершенна и существует высокая степень общей сложности последовательностей между мышами и людьми. [2] Разница между технологией «нок-ин» и традиционными трансгенными методами заключается в том, что «нок-ин» предполагает вставку гена в определенный локус и, таким образом, является «целевой» вставкой. Это противоположность нокауту генов .

Обычно технология «нок-ин» используется для создания моделей заболеваний. Это метод, с помощью которого научные исследователи могут изучать функцию регуляторного механизма (например, промоторов ), который управляет экспрессией заменяемого природного гена. Это достигается путем наблюдения за новым фенотипом рассматриваемого организма. В этом случае используются BAC , и YAC чтобы можно было передавать большие фрагменты.

Генный нокаут возник как небольшая модификация оригинальной техники нокаута, разработанной Мартином Эвансом , Оливером Смитисом и Марио Капеччи . Традиционно методы «нок-ин» полагались на гомологичную рекомбинацию для запуска целевой замены гена, хотя и другие методы, использующие транспозон -опосредованную систему для вставки целевого гена. были разработаны [3] использование фланкирующих сайтов loxP , которые вырезаются при экспрессии рекомбиназы Cre Примером этого является с генными векторами. Эмбриональные стволовые клетки с интересующей модификацией затем имплантируют в жизнеспособную бластоцисту , которая вырастет в зрелую химерную мышь с некоторыми клетками, имеющими исходную генетическую информацию о клетках бластоцисты, и другими клетками, имеющими модификации, введенные в эмбриональные стволовые клетки. Последующее потомство химерной мыши будет иметь нокаутированный ген. [4]

Нокаут генов впервые позволил провести основанные на гипотезах исследования модификаций генов и возникающих в результате фенотипов. Например, мутации в гене p53 человека могут быть вызваны воздействием бензо(а)пирена (BaP), а мутированная копия гена p53 может быть вставлена ​​в геном мыши. Опухоли легких , обнаруженные у нокаутированных мышей, подтверждают гипотезу о канцерогенности BaP . [5] Более поздние разработки в области техники «нок-ин» позволили свиньям встроить ген зеленого флуоресцентного белка с помощью системы CRISPR/Cas9 , что позволяет осуществлять гораздо более точные и успешные вставки гена. [6] Скорость нокаутирования генов, опосредованного CRISPR/Cas9, также позволяет биаллельные модификации некоторых генов и наблюдать фенотип у мышей в одном поколении, что является беспрецедентным периодом времени. генерировать [7]

Против нокаута гена

[ редактировать ]

Технология нокаута отличается от технологии нокаута тем, что технология нокаута направлена ​​​​либо на удаление части последовательности ДНК, либо на вставку нерелевантной информации о последовательности ДНК, чтобы нарушить экспрессию определенного генетического локуса. С другой стороны, технология генного нокаута изменяет интересующий генетический локус посредством замены один к одному информации о последовательности ДНК или путем добавления информации о последовательности, которая не обнаружена в указанном генетическом локусе. Таким образом, нокаут гена можно рассматривать как мутацию с приобретением функции , а нокаут гена — как мутацию с потерей функции , но нокаут гена может также включать замену функционального локуса гена на мутантный фенотип, который приводит к некоторой потере функции. [8]

Возможные применения

[ редактировать ]

Благодаря успеху методов нокаутирования генов, можно предвидеть множество клинических применений. Уже было показано , что введение мышам участков человеческого гена иммуноглобулина позволяет им производить гуманизированные антитела, которые являются терапевтически полезными. [9] Должно быть возможно модифицировать стволовые клетки у людей для восстановления целевой функции гена в определенных тканях, например, возможно, корректируя мутантный ген гамма-цепи рецептора IL-2 в гемопоэтических стволовых клетках для восстановления развития лимфоцитов у людей с Х-сцепленной тяжелой формой заболевания. комбинированный иммунодефицит . [4]

Ограничения

[ редактировать ]

Хотя технология генного нокаута оказалась мощной техникой для создания моделей заболеваний человека и понимания белков in vivo , все еще существуют многочисленные ограничения. Многие из них являются общими с ограничениями технологии нокаута. Во-первых, комбинации нокаутированных генов приводят к растущей сложности взаимодействий встроенных генов и их продуктов с другими участками генома и, следовательно, могут привести к большему количеству побочных эффектов и труднообъяснимых фенотипов . Кроме того, только несколько локусов, таких как локус ROSA26, охарактеризованы достаточно хорошо, и их можно использовать для условного нокайна генов; создание комбинаций репортера и трансгенов в одном и том же локусе проблематично. Самый большой недостаток использования нокаутированного гена для создания модели заболевания человека заключается в том, что физиология мыши не идентична человеческой, а человеческие ортологи белков, экспрессируемых у мышей, часто не полностью отражают роль гена в патологии человека. [10] Это можно увидеть на мышах, рожденных с мутацией фиброза ΔF508 в гене CFTR , которая составляет более 70% мутаций в этом гене для человеческой популяции и приводит к муковисцидозу . Хотя мыши ΔF508 CF действительно демонстрируют дефекты обработки, характерные для человеческой мутации, они не демонстрируют легочных патофизиологических изменений, наблюдаемых у людей, и практически не несут легочного фенотипа. [11] Такие проблемы можно было бы решить за счет использования различных моделей животных, а модели свиней (легкие свиньи имеют много биохимических и физиологических сходств с легкими человека) были созданы в попытке лучше объяснить активность мутации ΔF508. [12]

См. также

[ редактировать ]
  1. ^ Гибсон, Грег (2009). Учебник по геномной науке, 3-е изд . Сандерленд, Массачусетс: Синауэр. стр. 301–302. ISBN  978-0-87893-236-8 .
  2. ^ Консорциум по секвенированию генома мыши; Уотерстон, Роберт Х.; Линдблад-То, Керстин; Бирни, Юэн; Роджерс, Джейн; Абриль, Хосеп Ф.; Агарвал, Панкадж; Агарвала, Рича; Эйнскоу, Рэйчел (5 декабря 2002 г.). «Первичное секвенирование и сравнительный анализ генома мыши» . Природа . 420 (6915): 520–562. Бибкод : 2002Natur.420..520W . дои : 10.1038/nature01262 . ISSN   0028-0836 . ПМИД   12466850 .
  3. ^ Вестфаль, Швейцария; Ледер, П. (1 июля 1997 г.). «Сгенерированные транспозонами «нокаутирующие» и «нокинативные» конструкции, нацеленные на гены, для использования на мышах» . Современная биология . 7 (7): 530–533. дои : 10.1016/s0960-9822(06)00224-7 . ISSN   0960-9822 . ПМИД   9210379 .
  4. ^ Jump up to: а б Манис, Джон П. (13 декабря 2007 г.). «Нокаут, нокаут, нокаут – генетически манипулированные мыши и Нобелевская премия». Медицинский журнал Новой Англии . 357 (24): 2426–2429. дои : 10.1056/NEJMp0707712 . ISSN   1533-4406 . ПМИД   18077807 .
  5. ^ Лю, Жипей; Мюльбауэр, Карл-Рудольф; Шмайзер, Хайнц Х.; Хергенхан, Манфред; Белхаразем, Джеда; Холлштейн, Моника К. (1 апреля 2005 г.). «Мутации p53 в мышиных фибробластах человека, подвергшихся воздействию бензо(а)пирена, коррелируют с мутациями p53 в опухолях легких человека». Исследования рака . 65 (7): 2583–2587. дои : 10.1158/0008-5472.CAN-04-3675 . ISSN   0008-5472 . ПМИД   15805253 .
  6. ^ Жуань, Цзиньсюэ; Сюй, Куй; Ву, Цзинлян; Лю, Чжиго; Ян, Шулин (18 сентября 2015 г.) . опосредованный трансгенный нокин в локусе H11 у свиней» . Scientific Reports . 5 : 14253. Bibcode : ...514253R . doi : 10.1038/srep14253 . PMC   4585612. . PMID   26381350 2015NatSR
  7. ^ Ван, Яньлян; Ли, Джунхун; Сян, Цзиньчжу; Вэнь, Бинцян; Му, Хайюань; Чжан, Вэй; Хан, Цзянюн (10 декабря 2015 г.). «Высокоэффективное создание мышей с нокаутом двуаллельного репортерного гена посредством CRISPR-опосредованного редактирования генома ЭСК» . Белок и клетка . 7 (2): 152–156. дои : 10.1007/s13238-015-0228-3 . ISSN   1674-800X . ПМЦ   4742388 . ПМИД   26661644 .
  8. ^ Дойл, Альфред; МакГарри, Майкл П.; Ли, Нэнси А.; Ли, Джеймс Дж. (1 апреля 2012 г.). «Создание трансгенных и моделей заболеваний человека с нокаутом генов/ноккин-мышей» . Трансгенные исследования . 21 (2): 327–349. дои : 10.1007/s11248-011-9537-3 . ISSN   0962-8819 . ПМК   3516403 . ПМИД   21800101 .
  9. ^ Бенатуил, Лоренцо; Кэй, Джоэл; Кретин, Натали; Годвин, Джонатан Г.; Кариаппа, Аннайя; Пиллаи, Шив; Якомини, Джон (15 марта 2008 г.). «Мыши с нокаутом Ig, продуцирующие антиуглеводные антитела: прорыв В-клеток, производящих антисамостоятельные антитела с низким сродством» . Журнал иммунологии . 180 (6): 3839–3848. дои : 10.4049/jimmunol.180.6.3839 . ISSN   0022-1767 . ПМИД   18322191 .
  10. ^ Телькамп, Фредерик; Бенаду, Фарида; Бремер, Йерун; Гнарра, Мария; Кнювер, Яна; Шаффенрат, Сандра; Форхаген, Сюзанна (1 декабря 2014 г.). «Технология трансгенных мышей в биологии кожи: поколение нокаутных мышей» . Журнал исследовательской дерматологии . 134 (12): 1–3. дои : 10.1038/jid.2014.434 . ISSN   1523-1747 . ПМИД   25381772 .
  11. ^ Грабб, Барбара Р.; Баучер, Ричард К. (1 января 1999 г.). «Патофизиология генно-ориентированных мышиных моделей муковисцидоза». Физиологические обзоры . 79 (1): С193–С214. дои : 10.1152/physrev.1999.79.1.S193 . ISSN   0031-9333 . ПМИД   9922382 .
  12. ^ Роджерс, Кристофер С.; Хао, Яньхун; Рохлина Татьяна; Сэмюэл, Мелисса; Штольц, Дэвид А.; Ли, Юхонг; Петрова, Елена; Вермеер, Дэниел В.; Кабель, Аманда К. (1 апреля 2008 г.). «Производство гетерозиготных свиней по CFTR-null и CFTR-DeltaF508 путем нацеливания на ген, опосредованного аденоассоциированным вирусом, и переноса ядра соматических клеток» . Журнал клинических исследований . 118 (4): 1571–1577. дои : 10.1172/JCI34773 . ISSN   0021-9738 . ПМК   2265103 . ПМИД   18324337 .
[ редактировать ]
Arc.Ask3.Ru: конец переведенного документа.
Arc.Ask3.Ru
Номер скриншота №: 025bedb7e01bbe53da3511b468a2ec59__1704018060
URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/02/59/025bedb7e01bbe53da3511b468a2ec59.html
Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1:
Gene knock-in - Wikipedia
Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)