Клонирование Золотых Ворот
Клонирование Golden Gate или сборка Golden Gate [1] — это метод молекулярного клонирования , который позволяет исследователю одновременно и направленно собирать несколько фрагментов ДНК в единый фрагмент, используя ферменты рестрикции типа IIS и ДНК-лигазу Т4 . [2] Эта сборка выполняется in vitro . Наиболее часто используемые ферменты типа IIS включают BsaI, BsmBI и BbsI.
В отличие от стандартных ферментов рестрикции типа II, таких как EcoRI и BamHI , эти ферменты разрезают ДНК за пределами сайтов узнавания и, следовательно, могут создавать непалиндромные выступы . [3] Поскольку возможны 256 потенциальных выступающих последовательностей, можно собрать несколько фрагментов ДНК, используя комбинации выступающих последовательностей. [3] На практике это означает, что клонирование Золотых Ворот обычно не имеет шрамов. Кроме того, поскольку конечный продукт не имеет сайта узнавания фермента рестрикции типа IIS, правильно лигированный продукт не может быть снова разрезан ферментом рестрикции, а это означает, что реакция по существу необратима. [3] Это имеет множество преимуществ. Во-первых, можно проводить расщепление и лигирование фрагментов ДНК за одну реакцию, в отличие от традиционных методов клонирования , в которых эти реакции проводятся отдельно. Во-вторых, более высокая эффективность. [1] потому что конечный продукт не может быть снова разрезан ферментом рестрикции.
Типичный протокол термоциклера многократно колеблется от 37 ° C (оптимально для ферментов рестрикции) до 16 ° C (оптимально для лигаз). [4] Хотя этот метод можно использовать для одной вставки, исследователи использовали клонирование Golden Gate для одновременной сборки множества фрагментов ДНК. [5]
Бесшовное клонирование
[ редактировать ]Рубцовые последовательности часто встречаются при сборке многосегментной ДНК. В методе многосегментной сборки Gateway к донору добавляются сегменты с дополнительными последовательностями АТТ, которые перекрываются в этих добавленных сегментах, в результате чего сегменты разделяются последовательностями АТТ. [6] При сборке BioBrick рубцовая последовательность из восьми нуклеотидов, которая кодирует тирозин и стоп-кодон . между каждым добавленным в плазмиду сегментом остается [6]
В сборке Golden Gate используются ферменты рестрикции типа IIS, разрезающие их последовательности распознавания. [6] Кроме того, один и тот же фермент рестрикции типа IIS может образовывать множество различных выступающих частей на вставках и векторе; например, BsaI создает 256 выступов по четыре пары оснований. [6] Если выступы тщательно спроектированы, сегменты лигируются без рубцовых последовательностей между ними, и окончательная конструкция может быть квази-безрубцовой, где сайты рестрикционных ферментов остаются на обеих сторонах вставки. [6] Поскольку дополнительные сегменты могут быть вставлены в векторы без рубцов в открытой рамке считывания , Golden Gate широко используется в белковой инженерии . [6]
Плазмидный дизайн
[ редактировать ]Хотя клонирование Golden Gate ускоряет многосегментное клонирование, требуется тщательный дизайн донорских и реципиентных плазмид. [5] Ученые из биолабораторий Новой Англии успешно продемонстрировали сборку 35 фрагментов с помощью реакции сборки Golden Gate в одной пробирке. [7] Важным для этого метода сборки является то, что векторный остов целевой плазмиды и все фрагменты сборки фланкированы сайтами узнавания рестриктаз типа IIS, поскольку ферменты рестрикции этого подтипа разрезаются ниже своих сайтов узнавания . После разрезания каждая активная часть ДНК сборки имеет уникальные выступы, которые отжигаются со следующим фрагментом ДНК в запланированной сборке и лигируются, создавая сборку. Хотя также возможно, что выступающий конец отожжен обратно к своему исходному комплементарному выступу, связанному с вышестоящим сайтом узнавания, и лигируется, повторно образуя исходную последовательность, это будет подвержено дальнейшему разрезанию в ходе реакции сборки.
Стандарты клонирования
[ редактировать ]Сборка ДНК фермента рестрикции имеет стандарты клонирования, чтобы минимизировать изменения в эффективности клонирования и функции плазмиды, которые могут быть вызваны совместимостью сайтов рестрикции на вставке и сайтах на векторе. [8]
Стандарты клонирования сборки Golden Gate состоят из двух уровней. [8] Сборка Golden Gate первого уровня создает одногенную конструкцию путем добавления генетических элементов, таких как промотор, открытые рамки считывания и терминаторы. [8] Затем сборка Golden Gate второго уровня объединяет несколько конструкций, созданных в сборке первого уровня, для создания мультигенной конструкции. [8] Для сборки второго уровня используется система модульного клонирования (MoClo) и стандарт GoldenBraid2.0. [8]
Система МоКло
[ редактировать ]
Модульное клонирование, или MoClo, — это метод сборки, предложенный в 2011 году Эрнстом Вебером и др., посредством которого, используя сайты рестрикции типа IIS, пользователь может связать вместе по меньшей мере шесть частей ДНК в основную цепь в реакции в одном горшке. Это метод, основанный на сборке Golden Gate, при котором ферменты рестрикции типа IIS расщепляют за пределами своего сайта узнавания в одну сторону, что позволяет удалить эти сайты рестрикции из конструкции. Это помогает исключить образование лишних пар оснований или рубцов между частями ДНК. Однако для правильного лигирования MoClo использует набор сайтов слияния пар 4 оснований, которые остаются между частями после лигирования, образуя рубцы из пар 4 оснований между частями ДНК в конечной последовательности ДНК после лигирования двух или более частей. [9]
MoClo использует параллельный подход, при котором все конструкции первого уровня (модули уровня 0) имеют сайты рестрикции для BpiI по обе стороны от вставок. Вектор (также известный как «вектор назначения»), в который будут добавлены гены, имеет обращенный наружу сайт рестрикции BsaI с кассетой для скрининга выпадения. [8] LacZ представляет собой обычную кассету для скрининга, в которой она заменяется мультигенной конструкцией вектора назначения. [8] Каждая конструкция первого уровня и вектор имеют разные выступы, но дополняют выступы следующего сегмента, и это определяет расположение окончательной мультигенной конструкции. [8] Клонирование Золотых Врат обычно начинается с модулей уровня 0. [5] Однако если модуль уровня 0 слишком велик, клонирование начнется с фрагментов уровня -1, которые необходимо секвенировать, чтобы облегчить клонирование большой конструкции. [5] Если вы начинаете с фрагментов уровня -1, модули уровня 0 не нужно упорядочивать снова, тогда как если начинать с модулей уровня 0, модули необходимо упорядочивать. [5]
Модули уровня 0
[ редактировать ]Модули уровня 0 являются основой системы MoClo, где они содержат генетические элементы, такие как промотор, 5'-нетранслируемая область (UTR), кодирующая последовательность и терминатор. [5] Для целей клонирования Golden Gate внутренние последовательности модулей уровня 0 не должны содержать сайты рестрикции типа IIS для BsaI, BpiI и Esp3I, хотя они окружены двумя сайтами рестрикции BsaI в инвертированной ориентации. [5] Модули уровня 0 без фланкирования сайтов ограничения типа IIS могут добавлять сайты BsaI в процессе клонирования Golden Gate. [5]
Если модули уровня 0 содержат какой-либо нежелательный сайт рестрикции, их можно мутировать in silico путем удаления одного нуклеотида из сайта рестрикции типа IIS. [5] В этом процессе необходимо убедиться, что введенная мутация не повлияет на генетическую функцию, кодируемую интересующей последовательностью. [5] Предпочтительна молчащая мутация в кодирующей последовательности, поскольку она не меняет ни последовательность белка, ни функцию интересующего гена. [5]
Фрагменты уровня -1
[ редактировать ]Фрагменты уровня -1 используются для клонирования больших модулей уровня 0. [5] Для клонирования фрагментов уровня -1 можно использовать клонирование с тупым концом с рестрикционным лигированием. [5] Вектор, используемый при клонировании фрагментов уровня -1, не может содержать сайт рестрикции типа IIS BpiI, который используется на следующем этапе сборки. [5] Кроме того, на следующем этапе сборки вектор также должен иметь маркер селекции, отличный от целевого вектора, например, если в модулях уровня 0 используется устойчивость к спектиномицину, фрагменты уровня -1 должны иметь устойчивость к другому антибиотику, например к ампициллину. [5]
Конструкции 1 уровня
[ редактировать ]Вектор назначения уровня 1 определяет положение и ориентацию каждого гена в окончательной конструкции. [10] Существует четырнадцать доступных векторов уровня 1, которые различаются только последовательностью фланкирующих сайтов слияния, но идентичны во внутренних сайтах слияния. [10] Следовательно, все векторы могут собирать одни и те же части уровня 0. [10]
Поскольку все векторы уровня 1 представляют собой бинарные плазмиды, их используют для временной экспрессии, опосредованной Agrobacterium , в растениях. [10]
Конструкции 2 уровня
[ редактировать ]Векторы уровня 2 имеют два инвертированных сайта BpiI из-за вставки модулей уровня 1. [10] Верхний сайт слияния совместим с геном, клонированным в векторе уровня 1, тогда как нижний сайт слияния имеет универсальную последовательность. [10] Каждое клонирование позволяет вставить 2-6 генов в один и тот же вектор. [10]
Добавлять больше генов за один этап клонирования не рекомендуется, поскольку это приведет к получению неправильных конструкций. [10] С одной стороны, это может привести к увеличению количества сайтов рестрикции в конструкции, где открытая конструкция позволяет добавлять дополнительные гены. [10] С другой стороны, это также может устранить сайты рестрикции, где эта близкая конструкция останавливает дальнейшее добавление генов. [10]
Следовательно, конструкции из более чем шести генов требуют последовательных этапов клонирования, для чего требуются концевые линкеры, содержащие внутренние сайты рестрикции BsaI или BsmBI и синие или фиолетовые маркеры. [10] На каждом этапе клонирования необходимо чередовать сайт рестрикции и маркер. [10] Кроме того, необходимы два рестриктазы, где BpiI используется для высвобождения модулей уровня 1 из конструкций уровня 1, а BsaI/BsmBI предназначен для расщепления и открытия плазмиды уровня 2-n реципиента. [10] При скрининге правильные колонии должны меняться от синего к фиолетовому на каждом этапе клонирования, но если используется «закрытый» концевой линкер, колонии будут белыми. [10]
Конструкты уровня М
[ редактировать ]Векторы уровня M аналогичны векторам уровня 2, но имеют сайт BsaI, расположенный выше двух инвертированных сайтов BpiI. [11] Когда один или несколько генов клонируются в векторе уровня M, второй BsaI добавляется в конец конструкции через концевой линкер уровня M (ссылка). Это позволяет вырезать из вектора фрагмент, содержащий все собранные гены, и субклонировать его на следующем уровне клонирования (уровень P).
Конструкции уровня P
[ редактировать ]Векторы уровня P аналогичны конструкциям уровня M, за исключением того, что сайты BpiI заменены сайтами BsaI, а сайты BsaI заменены сайтами BpiI. Несколько конструкций уровня M с совместимыми сайтами слияния можно субклонировать в вектор уровня P за один этап. Теоретически в одну конструкцию можно собрать до 36 генов с использованием 6 параллельных реакций уровня M (каждая из которых необходима для сборки 6 генов на конструкцию уровня M), за которыми следует одна заключительная реакция уровня P. На практике обычно собирается меньше генов, поскольку для большинства проектов клонирования не требуется так много генов. Структура векторов уровней M и P спроектирована таким образом, что гены, клонированные в конструкциях уровня P, могут быть далее собраны в векторы уровня M. Повторное клонирование в векторах уровней M и P образует петлю, которую можно повторять бесконечно для сборки все более крупных конструкций.
Золотая коса
[ редактировать ]При стандартном клонировании Золотых Ворот сайты ограничения из конструкции предыдущего уровня не могут быть повторно использованы. [12] Чтобы добавить в конструкцию больше генов, к целевому вектору необходимо добавить сайты рестрикции другого фермента рестрикции типа IIS. [12] Это можно сделать, используя либо уровень 2, либо M и P. Вариант версии уровней M и P также предоставляется GoldenBraid.
GoldenBraid решает проблему создания множества векторов назначения за счет наличия двойной петли, которая представляет собой «косу», позволяющую осуществлять двоичную сборку нескольких конструкций. [12] Существует два уровня плазмид назначения: уровень α и уровень Ω. [12] Плазмиды каждого уровня можно использовать в качестве входных плазмид для плазмид другого уровня несколько раз, поскольку оба уровня плазмид имеют разные сайты рестрикции типа IIS, которые находятся в инвертированной ориентации. [12] Для контрселекции два уровня плазмид различаются по маркерам устойчивости к антибиотикам. [12]
Золотой мутагенез
[ редактировать ]Принцип клонирования Golden Gate также может быть применен для проведения мутагенеза, называемого Golden Mutagenesis. Эту технологию легко реализовать, поскольку для разработки праймеров доступен веб-инструмент ( https://msbi.ipb-halle.de/GoldenMutagenesisWeb/ ), а векторы хранятся в addgene ( http://www.addgene.org/browse) . /статья/28196591/ ). [13]
Имя
[ редактировать ]Название « Ассамблея Золотых ворот» происходит от предложения Юрия Глебы . [1] С одной стороны, это будет относиться к технологии Gateway , с другой стороны, к изображению более высокой точности с мостом, плавно соединяющим улицы двух берегов. Одним из самых известных мостов является мост Золотые Ворота в Сан-Франциско .
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с Энглер, Карола; Кандзия, Роми; Мариллонне, Сильвестр (5 ноября 2008 г.). «Один горшок, один шаг, метод точного клонирования с высокой производительностью» . ПЛОС ОДИН . 3 (11): е3647. Бибкод : 2008PLoSO...3.3647E . дои : 10.1371/journal.pone.0003647 . ISSN 1932-6203 . ПМК 2574415 . ПМИД 18985154 .
- ^ Биолаборатории, Новая Англия. «Ассамблея Золотых Ворот | НЭБ» . www.neb.com . Проверено 26 апреля 2017 г.
- ^ Jump up to: а б с Вебер, Эрнст; Энглер, Карола; Грюцнер, Рамона; Вернер, Стефан; Марильонне, Сильвестр (18 февраля 2011 г.). «Модульная система клонирования для стандартизированной сборки мультигенных конструкций» . ПЛОС ОДИН . 6 (2): e16765. Бибкод : 2011PLoSO...616765W . дои : 10.1371/journal.pone.0016765 . ISSN 1932-6203 . ПМК 3041749 . ПМИД 21364738 .
- ^ Энглер, Карола; Грюцнер, Рамона; Кандзия, Роми; Мариллонне, Сильвестр (14 мая 2009 г.). «Перетасовка Золотых Ворот: метод перетасовки ДНК в одном горшке, основанный на ферментах рестрикции типа II» . ПЛОС ОДИН . 4 (5): е5553. Бибкод : 2009PLoSO...4.5553E . дои : 10.1371/journal.pone.0005553 . ISSN 1932-6203 . ПМЦ 2677662 . ПМИД 19436741 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж г час я дж к л м н тот Энглер, Карола; Марильонне, Сильвестр (1 января 2014 г.). Клонирование Золотых Ворот . Методы молекулярной биологии . Том. 1116. стр. 119–131. дои : 10.1007/978-1-62703-764-8_9 . ISBN 978-1-62703-763-1 . ISSN 1940-6029 . ПМИД 24395361 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж Сэндс, Брайан; Брент, Роджер (01 января 2016 г.). «Обзор пост-методов Коэна-Бойера для односегментного клонирования и многосегментной сборки ДНК» . Современные протоколы молекулярной биологии . 113 (1): 3.26.1–3.26.20. дои : 10.1002/0471142727.mb0326s113 . ISSN 1934-3647 . ПМЦ 4853029 . ПМИД 27152131 .
- ^ Прайор, Джон М.; Потапов Владимир; Кучера, Ребекка Б.; Билотти, Катарина; Кантор, Эрик Дж.; Ломан, Грегори Дж.С. (02 сентября 2020 г.). «Возможность создания однопоточных сборок Golden Gate беспрецедентной сложности с использованием конструкции сборки, оптимизированной для данных» . ПЛОС ОДИН . 15 (9): e0238592. Бибкод : 2020PLoSO..1538592P . дои : 10.1371/journal.pone.0238592 . ISSN 1932-6203 . ПМЦ 7467295 . ПМИД 32877448 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж г час Казини, Артуро; Сторч, Марко; Болдуин, Джеффри С.; Эллис, Том (2015). «Кирпичики и чертежи: методы и стандарты сборки ДНК» (PDF) . Обзоры природы. Молекулярно-клеточная биология . 16 (9): 568–576. дои : 10.1038/nrm4014 . hdl : 10044/1/31281 . ISSN 1471-0080 . ПМИД 26081612 . S2CID 3502437 .
- ^ «Команда:BostonU/MoClo — 2014.igem.org» . 2014.igem.org . Проверено 11 сентября 2021 г.
- ^ Jump up to: а б с д и ж г час я дж к л м н Марильонне, Сильвестр; Вернер, Стефан (01 января 2015 г.). Сборка мультигенных конструкций с использованием клонирования Golden Gate . Методы молекулярной биологии . Том. 1321. стр. 269–284. дои : 10.1007/978-1-4939-2760-9_19 . ISBN 978-1-4939-2759-3 . ISSN 1940-6029 . ПМИД 26082229 .
- ^ Вернер С., Энглер С., Вебер Э., Грюцнер Р., Марилоннет С.Биоинженерные ошибки. 1 января 2012 г.;3(1):38-43.
- ^ Jump up to: а б с д и ж Саррион-Пердигонес, Алехандро; Фалькони, Эрика Эльвира; Зандалинас, Сара И.; Хуарес, Палома; Фернандес дель Хармен, Асун; Гранелл, Антонио; Орзаес, Диего (7 июля 2011 г.). «GoldenBraid: итеративная система клонирования для стандартизированной сборки многоразовых генетических модулей» . ПЛОС ОДИН . 6 (7): e21622. Бибкод : 2011PLoSO...621622S . дои : 10.1371/journal.pone.0021622 . ISSN 1932-6203 . ПМК 3131274 . ПМИД 21750718 .
- ^ Паскаль Пульманн, Крис Ульпиннис, Сильвестр Мариллонне, Рамона Грюцнер, Штеффен Нойманн (29 июля 2019 г.), «Золотой мутагенез: эффективный подход к мутагенезу с насыщением в нескольких местах путем клонирования Golden Gate с автоматическим дизайном праймеров», Scientific Reports (на немецком языке) ), т. 9, нет. 1, стр. 1–11, Bibcode : 2019NatSR...910932P , doi : 10.1038/s41598-019-47376-1 , ISSN 2045-2322 , PMC 6662682 , PMID 31358887
{{citation}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )