Превращение хлорида кальция
хлорида кальция ( CaCl 2 ) Трансформация — лабораторный метод в биологии прокариотических (бактериальных) клеток . [1] Добавление хлорида кальция к клеточной суспензии способствует связыванию плазмидной (ЛПС ) ДНК с липополисахаридами . Положительно заряженные кальция ионы притягивают как отрицательно заряженный остов ДНК, так и отрицательно заряженные группы во внутреннем ядре ЛПС. Затем плазмидная , где охлажденные ДНК может проникнуть в клетку при тепловом шоке клетки (+4 градуса Цельсия) на короткое время нагреваются до более высокой температуры (+42 градуса Цельсия).
История бактериальной трансформации
[ редактировать ]Фредерик Гриффит опубликовал первый отчет о потенциале бактерий к трансформации в 1928 году. [2] Гриффит заметил, что мыши не поддаются воздействию «грубого» типа пневмококка ( Streptococcus pneumoniae ), называемого невирулентным, но поддаются «гладкому» штамму, который называется вирулентным. Вирулентность гладкого штамма можно подавить путем термического уничтожения. Однако когда невирулентный шероховатый штамм был объединен с убитым нагреванием гладким штаммом, шероховатый штамм сумел приобрести гладкий фенотип и, таким образом, стать вирулентным. Исследование Гриффита показало, что это изменение было вызвано неживым, термостабильным веществом, образовавшимся в результате гладкого напряжения. Позже Освальд Эйвери, Колин Маклауд и Маклин Маккарти идентифицировали это трансформирующее вещество как ДНК в 1944 году. [3]
Принцип превращения хлорида кальция
[ редактировать ]Поскольку ДНК является очень гидрофильной молекулой , она часто не может проникнуть через мембрану бактериальной клетки. Следовательно, необходимо сделать бактерии компетентными для интернализации ДНК . Этого можно добиться, суспендируя бактерии в растворе с высокой концентрацией кальция , который создает крошечные отверстия в бактериальных клетках. [ нужна ссылка ] . Суспензия кальция вместе с инкубацией ДНК вместе с компетентными клетками на льду с последующим кратковременным тепловым шоком напрямую приведет к принудительному проникновению внехромосомной ДНК в клетку. [4]
Согласно предыдущим исследованиям, молекулы рецептора ЛПС на поверхности компетентной клетки связываются с голой молекулой ДНК . [1] Такое связывание происходит ввиду того, что отрицательно заряженные молекулы ДНК и ЛПС образуют координационные комплексы с двухвалентными катионами. Из-за своего размера ДНК не может самостоятельно пройти через клеточную мембрану и достичь цитоплазмы. Клеточная мембрана клеток, обработанных CaCl 2 , сильно деполяризуется на стадии теплового шока, и в результате падение мембранного потенциала уменьшает отрицательный характер внутреннего потенциала клетки, позволяя отрицательно заряженной ДНК течь внутрь клетки. . После этого мембранный потенциал можно вернуть к исходному значению с помощью последующего холодового шока. [4]
Компетентные клетки
[ редактировать ]Компетентные клетки — это бактериальные клетки с измененной клеточной стенкой, облегчающей проникновение чужеродной ДНК. Без специальной химической или электрической обработки, делающей их способными, большинство типов клеток не могут успешно усваивать ДНК , по этой причине обработка ионами кальция является типичной процедурой модификации бактерий, чтобы сделать их проницаемыми для ДНК. [5] У бактерий компетентность тщательно регулируется, и разные виды бактерий имеют разные характеристики, связанные с компетентностью. Хотя они имеют некоторое сходство, белки компетентности, генерируемые грамположительными и грамотрицательными бактериями, различны. [6]
Естественная компетентность
[ редактировать ]Естественная компетентность выражается в трех методах, с помощью которых бактерии могут приобретать ДНК из окружающей среды: конъюгация , трансформация и трансдукция . [7] Поскольку ДНК встраивается в клетку во время трансформации, клетки-реципиенты должны находиться в определенном физиологическом состоянии, известном как компетентное состояние, чтобы принять трансформирующую ДНК . [6] Как только ДНК попадает в цитоплазму клетки, ферменты, такие как нуклеаза, могут разрушить ее. В тех случаях, когда ДНК очень похожа на собственный генетический материал клетки, ферменты, восстанавливающие ДНК, вместо этого рекомбинируют ее с хромосомой. [8]
Искусственная компетентность
[ редактировать ]Очевидно, что гены клетки не несут никакой информации об искусственной компетентности. Этот тип компетентности требует лабораторного процесса, который создает условия, которые не часто существуют в природе, чтобы клетки могли стать проницаемыми для ДНК . [9] Хотя эффективность трансформации часто бывает низкой, этот процесс относительно прост и быстр, чтобы его можно было применить в генной инженерии бактерий. Мандель и Хига, [10] который создал простую процедуру, основанную на вымачивании клеток в холодном CaCl 2 , заложил основу для получения синтетических компетентных клеток. Химическая трансформация, такая как трансформация хлорида кальция и электропорация, являются наиболее часто используемыми методами трансформации бактериальных клеток, таких как клетки E.coli , плазмидной ДНК . [5]
Способ превращения хлорида кальция
[ редактировать ]Обработка хлоридом кальция обычно используется для трансформации кишечной палочки и других бактерий. [11] Он усиливает включение плазмидной ДНК в бактериальную клетку, способствуя генетической трансформации . Плазмидная ДНК может прикрепляться к ЛПС при добавлении к клеточному раствору вместе с CaCl 2 . [12] Таким образом, при применении теплового шока отрицательно заряженный остов ДНК и ЛПС объединяются, позволяя плазмидной ДНК проникнуть в бактериальную клетку. [13]
этот процесс сводится к следующим этапам В соответствии с протоколом Студенческого журнала экспериментальной микробиологии и иммунологии (UJEMI), :
- Приготовьте бактериальную культуру в бульоне LB.
- Перед началом основной процедуры используйте необходимый объем ранее приготовленной культуры для инокуляции необходимого объема свежего бульона LB.
- Осадите клетки центрифугированием при 4°C и 4000 об/мин в течение 10 минут.
- Слейте супернатант и ресуспендируйте клетки в 20 мл ледяного 0,1 М CaCl 2 , затем немедленно оставьте на льду на 20 минут.
- Центрифугируйте, как на этапе 3, будет получен более диффузный осадок, что указывает на наличие компетентных клеток.
- Ресуспендируйте в холодном CaCl 2, как описано в шаге 4.
- Слейте супернатант и ресуспендируйте клетки в 5 мл ледяного 0,1 М CaCl 2 вместе с 15% глицерином, чтобы объединить осадки.
- Перенесите суспензии в стерильные тонкие стеклянные пробирки для эффективного теплового шока.
- Добавьте необходимое количество мг ДНК в пробирки с суспензией и немедленно оставьте на льду.
- Поместите пробирки на водяную баню с температурой 42°C на 30 секунд и немедленно верните на лед на 2 минуты.
- Добавьте 1 мл среды LB или SOC.
- Перенесите каждую пробирку в необходимое количество мл LB бульона в новую колбу.
- Инкубируйте соответствующим образом при встряхивании при температуре 37°C и скорости 200 об/мин в течение 60 минут, однако рекомендуется оставить инкубацию на 90 минут, чтобы дать возможность бактериям восстановиться.
- Разведения 1:10 и 1:100 инкубированных культур на селективных/скрининговых чашках (например, с ампициллином и/или X-гал) на чашках LB, к которым были добавлены антибиотики, которые будут использоваться для селекции.
- Инкубируйте в течение ночи при 37°C.
- Наконец, наблюдайте за изолированными колониями на чашках.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б Дагерт, М.; Эрлих, С. (1979). «Длительная инкубация в хлориде кальция улучшает компетентность клеток Escherichia coli». Джин . 6 (1): 23–28. дои : 10.1016/0378-1119(79)90082-9 . ПМИД 383576 .
- ^ Гриффит, Фред (январь 1928 г.). «Значение типов пневмококков» . Журнал гигиены . 27 (2): 113–159. дои : 10.1017/s0022172400031879 . ISSN 0022-1724 . ПМК 2167760 . ПМИД 20474956 . S2CID 44003929 .
- ^ Эйвери, Освальд Т.; Маклауд, Колин М.; Маккарти, Маклин (май 1995 г.). «Исследование химической природы вещества, вызывающего трансформацию типов пневмококков» . Молекулярная медицина . 1 (4): 344–365. дои : 10.1007/bf03401572 . ISSN 1076-1551 . ПМК 2229990 . ПМИД 8521292 .
- ^ Jump up to: а б « CaCl 2 Техника трансформации » . Учебный центр MyBioSource . Проверено 4 января 2023 г.
- ^ Jump up to: а б Фрегель, Р.; Родригес, В.; Кабрера, В.М. (апрель 2008 г.). «Микроволновая печь улучшила трансформацию Escherichia coli» . Письма по прикладной микробиологии . 46 (4): 498–499. дои : 10.1111/j.1472-765X.2008.02333.x . ISSN 0266-8254 . ПМИД 18284557 . S2CID 14569911 .
- ^ Jump up to: а б Зейтц, Патрик; Блокеш, Мелани (2013). «Символы и регуляторные пути, участвующие в естественной компетентности и трансформации патогенных и экологических грамотрицательных бактерий» . Обзоры микробиологии FEMS . 37 (3): 336–363. дои : 10.1111/j.1574-6976.2012.00353.x . ПМИД 22928673 . S2CID 30861416 .
- ^ Фишер, Вольфганг; Хофройтер, Дирк; Хаас, Райнер (09 апреля 2014 г.), «Естественная трансформация, рекомбинация и восстановление» , Helicobacter pylori , Вашингтон, округ Колумбия, США: ASM Press, стр. 249–257, doi : 10.1128/9781555818005.ch22 , ISBN 9781683672388 , получено 4 января 2023 г.
- ^ « Биологическая наука . Пятое издание. Том 1: Клетка, генетика и развитие. Скотт Фриман, Лизабет Эллисон, Майкл Блэк, Грег Подгорски, Ким Куиллин, Джон Монро и Эмили Тейлор. Бостон (Массачусетс): Пирсон. $ 85,20 ( бумага). xxxi + 443 с.; А:1–А:52; В:1–Г:39; 1–I: 42 (индекс ISBN 978-0-321-84180-3) . Ежеквартальный обзор биологии . 88 (4): 329. Декабрь 2013 г. doi : 10.1086/673770 . ISSN 0033-5770 .
- ^ Ёсида, Наото; Сато, Миса (июль 2009 г.). «Поглощение плазмид бактериями: сравнение методов и эффективности» . Прикладная микробиология и биотехнология . 83 (5): 791–798. дои : 10.1007/s00253-009-2042-4 . ISSN 0175-7598 . ПМИД 19471921 . S2CID 24211143 .
- ^ Мандель, М.; Хига, А. (октябрь 1970 г.). «Кальций-зависимая ДНК-инфекция бактериофага» . Журнал молекулярной биологии . 53 (1): 159–162. дои : 10.1016/0022-2836(70)90051-3 . ISSN 0022-2836 . ПМИД 4922220 .
- ^ Хигучи-Такеучи, Миэко; Морисаки, Кумико; Нумата, Кейджи (январь 2020 г.). «Метод легкой трансформации морских пурпурных фотосинтезирующих бактерий с использованием химически компетентных клеток» . МикробиологияОткрыть . 9 (1): e00953. дои : 10.1002/mbo3.953 . ISSN 2045-8827 . ПМЦ 6957439 . ПМИД 31638342 .
- ^ Ханахан, Дуглас (июнь 1983 г.). «Исследования по трансформации Escherichia coli плазмидами» . Журнал молекулярной биологии . 166 (4): 557–580. дои : 10.1016/s0022-2836(83)80284-8 . ISSN 0022-2836 . ПМИД 6345791 .
- ^ Наката, Ясухико; Тан, Сяорэнь; Йокояма, Казунари К. (1996), "Подготовка компетентных клеток для высокоэффективной плазмидной трансформации Escherichia coli" , Протоколы библиотеки кДНК , vol. 69, Нью-Джерси: Humana Press, стр. 129–138, doi : 10.1385/0-89603-383-x:129 , ISBN. 0-89603-383-Х , PMID 9116846 , получено 4 января 2023 г.