Эксперимент Эйвери-Маклауда-Маккарти
Эксперимент Эйвери-Маклауда-Маккарти был экспериментальной демонстрацией Освальда Эйвери , Колина Маклауда и Маклина Маккарти , которые в 1944 году сообщили, что ДНК является веществом, вызывающим бактериальную трансформацию , в эпоху, когда широко считалось, что это белки. который выполнял функцию переноса генетической информации (само слово «белок» было придумано для обозначения убеждения в том, что его функция является первичной ). Это была кульминация исследований 1930-х и начала 20-го века в Институте медицинских исследований Рокфеллера по очистке и характеристике «преобразующего принципа», ответственного за феномен трансформации, впервые описанный в эксперименте Гриффита 1928 года: убитый Streptococcus pneumoniae вирулентного . штамма III-S при введении вместе с живыми, но невирулентными пневмококками типа II-R приводил к смертельному заражению пневмококками типа III-S. В статье « Исследование химической природы вещества, индуцирующего трансформацию пневмококков: индукция трансформации фракцией дезоксирибонуклеиновой кислоты, выделенной из пневмококка III типа». «, опубликованная в февральском выпуске журнала « Экспериментальная медицина» за 1944 год , Эйвери и его коллеги предполагают, что ДНК, а не белок, как широко считалось в то время, может быть наследственным материалом бактерий и может быть аналогичен генам и/или вирусы в высших организмах. [1] [2]
Предыстория [ править ]
С развитием серологического типирования исследователи-медики смогли разделить бактерии на различные штаммы или типы . Когда человеку или подопытному животному (например, мыши ) прививают определенный тип, возникает иммунный ответ , генерирующий антитела , которые специфически реагируют с антигенами бактерий. Затем сыворотку крови, содержащую антитела, можно извлечь и нанести на культивируемые бактерии . Антитела будут реагировать с другими бактериями того же типа, что и исходная инокуляция. Фред Нойфельд , немецкий бактериолог, открыл типы пневмококков и серологическое типирование; До исследований Фредерика Гриффита бактериологи считали, что типы фиксированы и неизменны от одного поколения к другому. [3]
Эксперимент Гриффита , описанный в 1928 году, [4] определили, что некий «преобразующий принцип» пневмококковых бактерий может трансформировать их из одного типа в другой. Гриффит, британский медицинский работник, потратил годы на применение серологического типирования к случаям пневмонии , часто смертельной болезни в начале 20-го века. Он обнаружил, что в течение клинического случая пневмонии часто присутствовало несколько типов — как вирулентных, так и невирулентных, и предположил, что один тип может смениться другим (а не просто постоянно присутствовать несколько типов). Проверяя эту возможность, он обнаружил, что трансформация могла произойти, когда мышам вводили как мертвые бактерии вирулентного типа, так и живые бактерии невирулентного типа: у мышей развивалась смертельная инфекция (обычно вызываемая только живыми бактериями вирулентного типа). тип) и погибают, и из таких инфицированных мышей можно выделить вирулентные бактерии. [5]
Результаты эксперимента Гриффита вскоре были подтверждены, сначала Фредом Нойфельдом. [6] в Институте Коха и Мартином Генри Доусоном в Институте Рокфеллера. [7] В последующие годы ряд исследователей Института Рокфеллера продолжали изучать трансформацию. Вместе с Ричардом Сиа Доусон разработал метод трансформации бактерий in vitro (а не in vivo, как это сделал Гриффит). [8] После ухода Доусона в 1930 году Джеймс Аллоуэй предпринял попытку расширить открытия Гриффита, в результате чего к 1933 году удалось извлечь водные растворы преобразующего принципа. Колин Маклауд работал над очисткой таких растворов с 1934 по 1937 год, и работа была продолжена в 1940 году. и завершен Маклин Маккарти. [9] [10]
Экспериментальная работа [ править ]
Пневмококк характеризуется гладкими колониями, имеющими полисахаридную капсулу, индуцирующую антител образование ; различные типы классифицируются в соответствии с их иммунологической специфичностью. [1]
Процедура очистки, которую предпринял Эйвери, заключалась в том, чтобы сначала уничтожить бактерии нагреванием и извлечь растворимые в физиологическом растворе компоненты. Затем белок осаждали хлороформом , капсулы полисахарида гидролизовали ферментом . а Для подтверждения полного разрушения капсул использовали иммунологическое осаждение, вызванное типоспецифичными антителами. Затем активную часть осаждали спиртовым фракционированием , в результате чего образовывались волокнистые нити, которые можно было удалить с помощью мешалки. [1]
Химический анализ показал, что пропорции углерода, водорода, азота и фосфора в этой активной части соответствуют химическому составу ДНК. Чтобы показать, что за трансформацию отвечает именно ДНК, а не какое-то небольшое количество РНК , белка или какого-либо другого компонента клетки, Эйвери и его коллеги использовали ряд биохимических тестов. Они обнаружили, что трипсин , химотрипсин и рибонуклеаза (ферменты, расщепляющие белки или РНК) не влияют на него, но ферментный препарат «дезоксирибонуклеодеполимераза» (сырой препарат, получаемый из ряда животных источников, который может расщеплять ДНК) разрушает преобразующая сила экстракта. [1]
Последующая работа в ответ на критику и проблемы включала очистку и кристаллизацию Мозесом Куницем в 1948 году ДНК-деполимеразы ( дезоксирибонуклеазы I ), а также точную работу Роллина Хочкисса, показавшую, что практически весь обнаруженный азот в очищенной ДНК произошел из глицин , продукт распада нуклеотидного основания аденин , и что необнаруженное загрязнение белка составляло не более 0,02% по оценке Хотчкисса. [11] [12]
и наследие Прием
Экспериментальные результаты эксперимента Эйвери-Маклауда-Маккарти были быстро подтверждены и распространены на другие наследственные характеристики, помимо полисахаридных капсул. Однако было значительное нежелание принять вывод о том, что ДНК является генетическим материалом. Согласно » Феба Левена влиятельной « тетрануклеотидной гипотезе , ДНК состоит из повторяющихся единиц четырех нуклеотидных оснований и не имеет мало биологической специфичности. Поэтому считалось, что ДНК является структурным компонентом хромосом , тогда как считалось, что гены состоят из белкового компонента хромосом. [13] [14] Эта точка зрения была подкреплена кристаллизацией вируса табачной мозаики в 1935 году Уэнделлом Стэнли , [15] и параллели между вирусами, генами и ферментами; Многие биологи считали, что гены могут быть своего рода «суперферментами», а, по мнению Стэнли, вирусы были белками и разделяли свойство автокатализа со многими ферментами. [16] Более того, лишь немногие биологи думали, что генетику можно применить к бактериям, поскольку у них отсутствуют хромосомы и половое размножение . В частности, многие генетики, неофициально известные как группа фагов , которая стала влиятельной в новой дисциплине молекулярной биологии в 1950-х годах, пренебрегали ДНК как генетическим материалом (и были склонны избегать «беспорядочных» биохимических подходов, Эйвери и его коллеги). Некоторые биологи, в том числе научный сотрудник Рокфеллеровского института Альфред Мирски , оспорили вывод Эйвери о том, что принципом трансформации является чистая ДНК, предполагая, что виноваты белковые примеси. [13] [14] Хотя трансформация произошла у некоторых видов бактерий, она не могла быть воспроизведена ни у других бактерий (ни у каких-либо высших организмов), и ее значение, по-видимому, ограничивалось в первую очередь медициной. [13] [17]
Ученые, оглядываясь назад на эксперимент Эйвери-Маклауда-Маккарти, расходятся во мнениях относительно того, насколько влиятельным он был в 1940-х и начале 1950-х годов. Гюнтер Стент предположил, что это явление в значительной степени игнорировалось и отмечалось лишь впоследствии — аналогично работе Грегора Менделя за десятилетия до возникновения генетики . Другие, такие как Джошуа Ледерберг и Лесли К. Данн , подтверждают его раннее значение и называют этот эксперимент началом молекулярной генетики . [18]
Некоторые микробиологи и генетики проявляли интерес к физической и химической природе генов до 1944 года, но эксперимент Эйвери-Маклауда-Маккарти возобновил и расширил интерес к этому предмету. Хотя в оригинальной публикации конкретно генетика не упоминалась, Эйвери, как и многие генетики, читавшие статью, знали о генетических последствиях — что Эйвери, возможно, изолировал сам ген в виде чистой ДНК. Биохимик Эрвин Чаргафф , генетик Г. Дж. Мюллер и другие высоко оценили этот результат как установление биологической специфичности ДНК и как имеющий важное значение для генетики, если ДНК играет аналогичную роль в высших организмах. В 1945 году Королевское общество наградило Эйвери медалью Копли , отчасти за его работу по трансформации бактерий. [19]
В период с 1944 по 1954 год статья цитировалась не менее 239 раз (причём цитирование распределялось равномерно в течение этих лет), в основном в статьях по микробиологии, иммунохимии и биохимии. В дополнение к последующей работе Маккарти и других сотрудников Института Рокфеллера в ответ на критику Мирского, эксперимент стимулировал значительную работу в микробиологии, где он пролил новый свет на аналогии между бактериальной наследственностью и генетикой организмов, размножающихся половым путем. [17] Французский микробиолог Андре Буавен заявил, что распространил результаты исследований Эйвери на бактериальную трансформацию на Escherichia coli . [20] хотя это не могло быть подтверждено другими исследователями. [17] Однако в 1946 году Джошуа Ледерберг и Эдвард Татум продемонстрировали бактериальную конъюгацию в E. coli и показали, что генетика может применяться к бактериям, даже если конкретный метод трансформации Эйвери не был универсальным. [21] Работа Эйвери также побудила Мориса Уилкинса продолжить рентгеновские кристаллографические исследования ДНК, даже несмотря на то, что он столкнулся с давлением со стороны спонсоров, требующих сосредоточить свои исследования на целых клетках, а не на биомолекулах. [17]
Несмотря на значительное количество цитирований на статью и положительные отзывы, полученные в годы после публикации, работа Эйвери в значительной степени игнорировалась большей частью научного сообщества. Хотя этот эксперимент был положительно воспринят многими учеными, он не оказал серьезного влияния на основные генетические исследования, отчасти потому, что он не имел большого значения для классических генетических экспериментов, в которых гены определялись по их поведению в экспериментах по селекции, а не по их химическому составу. Г. Дж. Мюллер, хотя и был заинтересован, больше сосредоточился на физических, а не на химических исследованиях гена, как и большинство членов группы фагов . Работа Эйвери также была проигнорирована Нобелевским фондом , который позже выразил публичное сожаление по поводу того, что ему не удалось присудить Эйвери Нобелевскую премию . [22]
Ко времени эксперимента Херши-Чейза в 1952 году генетики были более склонны рассматривать ДНК как генетический материал, а Альфред Херши был влиятельным членом группы фагов. [23] [24] Эрвин Чаргафф показал, что базовый состав ДНК варьируется в зависимости от вида (вопреки гипотезе тетрануклеотидов). [25] а в 1952 году Роллин Хочкисс опубликовал свои экспериментальные данные, подтверждающие работу Чаргаффа и демонстрирующие отсутствие белка в преобразующем принципе Эйвери. [26] Более того, область бактериальной генетики быстро развивалась, и биологи были более склонны рассматривать наследственность в одних и тех же терминах для бактерий и высших организмов. [23] [24] После того, как Херши и Чейз использовали радиоактивные изотопы, в бактерии попадает в первую очередь ДНК, а не белок чтобы показать, что при заражении бактериофагом , [27] вскоре было широко признано, что ДНК является материалом. Несмотря на гораздо менее точные экспериментальные результаты (они обнаружили немалое количество белка, проникающего в клетки, а также ДНК), эксперимент Херши-Чейза не подвергался такой же степени сложности. Его влияние было усилено растущей сетью группы фагов, а в следующем году - гласностью вокруг структуры ДНК, предложенной Уотсоном и Криком (Уотсон также был членом группы фагов). Однако только в ретроспективе оба эксперимента окончательно доказали, что ДНК является генетическим материалом. [23] [24]
Примечания [ править ]
- ^ Jump up to: Перейти обратно: а б с д Эйвери, Освальд Т.; Колин М. МакЛауд; Маклин Маккарти (1 февраля 1944 г.). «Исследование химической природы вещества, индуцирующего трансформацию пневмококков: индукция трансформации фракцией дезоксирибонуклеиновой кислоты, выделенной из пневмококка III типа» . Журнал экспериментальной медицины . 79 (2): 137–158. дои : 10.1084/jem.79.2.137 . ПМК 2135445 . ПМИД 19871359 .
- ^ Фрутон (1999), стр. 438–440.
- ^ Лерер, Стивен. Исследователи тела. 2-е издание. iuniverse, 2006, стр. 46 [1]
- ^ Гриффит, Фредерик (январь 1928 г.). «Значение типов пневмококков» . Журнал гигиены . 27 (2): 113–159. дои : 10.1017/S0022172400031879 . JSTOR 4626734 . ПМК 2167760 . ПМИД 20474956 .
- ^ Доус, Хизер (август 2004 г.). «Тихая революция» . Современная биология . 14 (15): Р605–Р607. дои : 10.1016/j.cub.2004.07.038 . ПМИД 15296771 .
- ^ Нойфельд, Фред; Левинталь, Вальтер (1928). «Вклад в пневмококковую изменчивость» . Журнал иммунологических исследований . 55 : 324-340.
- ^ Доусон, Миннесота (1 января 1930 г.). «Трансформация типов пневмококков: II. Взаимоконвертируемость типоспецифичных пневмококков S» . Журнал экспериментальной медицины . 51 (1): 123–47. дои : 10.1084/jem.51.1.123 . ПМК 2131805 . ПМИД 19869670 .
- ^ Доусон, Мартин Х.; Сиа, Ричард HP (1930). «Трансформация типов пневмококков in vitro» . Труды Общества экспериментальной биологии и медицины . 27 (9): 989–990. дои : 10.3181/00379727-27-5078 . S2CID 84395600 .
- ^ Фрутон (1999), с. 438
- ^ Коллекция Освальда Т. Эйвери: « Смещение фокуса: ранние работы по бактериальной трансформации, 1928–1940 ». Профили в науке . Национальная медицинская библиотека США. По состоянию на 25 февраля 2009 г.
- ^ Фрутон (1999), с. 439
- ^ Виткин Э.М. (август 2005 г.). «Вспоминая Роллина Хочкисса (1911–2004)» . Генетика . 170 (4): 1443–7. дои : 10.1093/генетика/170.4.1443 . ПМЦ 1449782 . ПМИД 16144981 .
- ^ Jump up to: Перейти обратно: а б с Моранж (1998), стр. 30–39
- ^ Jump up to: Перейти обратно: а б Фрутон (1999), стр. 440–441.
- ^ Стэнли, Венделл М. (28 июня 1935 г.). «Выделение кристаллического белка, обладающего свойствами вируса табачной мозаики» (PDF) . Наука . Новая серия. 81 (2113): 644–645. Бибкод : 1935Sci....81..644S . дои : 10.1126/science.81.2113.644 . JSTOR 1658941 . ПМИД 17743301 . Архивировано из оригинала (PDF) 27 сентября 2006 г. Проверено 26 февраля 2009 г.
- ^ О пересекающихся теориях вирусов, генов и ферментов в этот период см.: Крегер, Анджела Н.Х. Жизнь вируса: вирус табачной мозаики как экспериментальная модель, 1930–1965 . Издательство Чикагского университета: Чикаго, 2002. ISBN 0-226-12025-2
- ^ Jump up to: Перейти обратно: а б с д Дайхманн, стр. 220–222.
- ^ Дайхманн, стр. 207–209.
- ^ Дайхманн, стр. 215–220.
- ^ Бойвин; Бойвен, Андре; Вендрели, Роджер; Лехульт, Ивонн (1945). «Высокополимеризованная тимонуклеиновая кислота - принцип, способный определять серологическую специфичность и ферментативный аппарат бактерий. Последствия для биохимии наследственности». Отчеты . 221 :646–648.
- ^ Ледерберг, Джошуа; Эдвард Л. Татум (19 октября 1946 г.). «Рекомбинация генов в Escherichia Coli » . Природа . 158 (4016): 558. Бибкод : 1946Natur.158..558L . дои : 10.1038/158558a0 . ПМИД 21001945 . S2CID 1826960 .
- ^ Дайхманн, стр. 227–231.
- ^ Jump up to: Перейти обратно: а б с Моранж (1998), стр. 44–50
- ^ Jump up to: Перейти обратно: а б с Фрутон (1999), стр. 440–442.
- ^ Чаргафф Э. (июнь 1950 г.). «Химическая специфичность нуклеиновых кислот и механизм их ферментативной деградации». Эксперименты . 6 (6): 201–9. дои : 10.1007/BF02173653 . ПМИД 15421335 . S2CID 2522535 .
- ^ Хочкисс, Роланд Д. «Роль дезоксирибонуклеотидов в бактериальных трансформациях». В У. Д. МакЭлрое; Б. Гласс (ред.). Фосфорный обмен . Балтимор: Издательство Университета Джонса Хопкинса. стр. 426–36.
- ^ Херши А.Д., Чейз М. (май 1952 г.). «Независимые функции вирусного белка и нуклеиновой кислоты в росте бактериофага» . Журнал общей физиологии . 36 (1): 39–56. дои : 10.1085/jgp.36.1.39 . ПМК 2147348 . ПМИД 12981234 .
Ссылки [ править ]
- Дайхманн, ЮТЕ (2004). «Ранние ответы на статью Эйвери и др. о ДНК как наследственном материале». Исторические исследования в области физических и биологических наук . 34 (2): 207–32. дои : 10.1525/hsps.2004.34.2.207 .
- Фрутон, Джозеф С. (1999). Белки, ферменты, гены: взаимодействие химии и биологии . Нью-Хейвен, Коннектикут: Издательство Йельского университета. ISBN 978-0-300-07608-0 .
- Кобб, Мэтью ; Моранж, Мишель (1998). История молекулярной биологии . Кембридж: Издательство Гарвардского университета. ISBN 978-0-674-00169-5 .
- Лерер, Стивен (2006). Исследователи тела: драматические прорывы в медицине от древних времен до современной науки . США: iUniverse. ISBN 978-0-595-40731-6 .
- Фрай, Майкл (2016) Знаменательные эксперименты в молекулярной биологии; Elsevier-Academic Press, США, ISBN 9780128020746
Дальнейшее чтение [ править ]
- Ледерберг Дж. (февраль 1994 г.). «Трансформация генетики с помощью ДНК: празднование юбилея Эйвери, МакЛауда и Маккарти (1944)» . Генетика . 136 (2): 423–6. дои : 10.1093/генетика/136.2.423 . ПМЦ 1205797 . ПМИД 8150273 .
- Маккарти, Маклин (1986). Принцип трансформации: открытие того, что гены состоят из ДНК . Нью-Йорк: Нортон. ISBN 978-0-393-30450-3 .
- Стегенга, Джейкоб (2011). «Химическая характеристика гена: превратности доказательной оценки» . История и философия наук о жизни . 33 (1): 105–127. ПМИД 21789957 .
