Эко- дом на колесах
| Эндонуклеаза рестрикции EcoRV | |||
|---|---|---|---|
 Кристаллическая структура EcoRV в комплексе с двухцепочечной ДНК | |||
| Идентификаторы | |||
| Символ | Эндонук-ЭкоРВ | ||
| Пфам | PF09233 | ||
| ИнтерПро | ИПР015314 | ||
| СКОП2 | 1sx5 / СКОПе / СУПФАМ | ||
| |||
Eco RV (произносится как «эко R пять») представляет собой эндонуклеазу рестрикции типа II , выделенную из некоторых штаммов Escherichia coli . Имеет альтернативное название Eco32I.
В молекулярной биологии это широко используемый фермент рестрикции . Это создает тупые концы . Фермент распознает палиндромную последовательность ДНК из 6 оснований 5'-GAT|ATC-3' и делает тупой конец на вертикальной линии. [1] Тогда комплементарной последовательностью будет 3'-CTA|TAG-5'. Концы тупые, и их можно легко лигировать в тупой участок клонирования, но с меньшей эффективностью, чем липкие концы.
Структура
[ редактировать ]Структура этого фермента и нескольких мутантов в комплексе с последовательностью ДНК, которую он разрезает, была решена с помощью рентгеновской кристаллографии .
Ядро фермента состоит из пятицепочечного смешанного β-листа, окруженного α-спиралями. Ядро консервативно во всех других эндонуклеазах рестрикции типа II. Он также имеет N-концевой субдомен димеризации, образованный короткой α-спиралью, двухцепочечным антипараллельным листом и длинной α-спиралью. Этот поддомен встречается только в EcoRV и PvuII. [2]
Способ действия
[ редактировать ]Подобно EcoRI , EcoRV образует гомодимер в растворе перед связыванием и действием на последовательность узнавания . [3] Первоначально фермент слабо связывается с неспецифическим участком ДНК. Он случайным образом перемещается по молекуле, пока не будет найден конкретный сайт узнавания. [2] EcoRV обладает высокой специфичностью к целевой последовательности ДНК.
Связывание фермента вызывает конформационное изменение ДНК, изгибая ее примерно на 50°. Изгиб ДНК приводит к расслоению оснований, расширению малой бороздки и сжатию большой бороздки. Это приводит к разрыву фосфодиэфирной связи ближе к активному центру фермента, где она может быть расщеплена. Расщепление происходит внутри последовательности узнавания и не требует гидролиза АТФ. [2]
EcoRV - единственная эндонуклеаза рестрикции типа II , которая, как известно, вызывает серьезные конформационные изменения ДНК, индуцированные белками. [2]
Использование
[ редактировать ]EcoRV часто используется для разрезания плазмидного вектора и вставки гена интересующего во время клонирования гена . Фермент поставляется многими производителями, и для его правильной работы требуется бычий сывороточный альбумин .
См. также
[ редактировать ]- EcoRI , еще один фермент нуклеаза из E. coli .
- EcoRII , еще один фермент нуклеаза из E. coli .
- FokI , a nuclease enzyme from Flavobacterium okeanokoites [4]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Шильдкраут I, Banner CD, Родос CS, Парех С (1984). «Сайтом расщепления эндонуклеазы рестрикции EcoRV является 5'-GAT/ATC». Джин . 27 (3): 327–329. дои : 10.1016/0378-1119(84)90078-7 . ПМИД 6329909 .
- ^ Jump up to: а б с д Пингуд А., Йельч А. (2001). «Структура и функции эндонуклеаз рестрикции II типа» . Исследования нуклеиновых кислот . 29 (18): 3705–3727. дои : 10.1093/нар/29.18.3705 . ПМК 55916 . ПМИД 11557805 .
- ^ Битинайте Дж., Ва Д.А., Аггарвал А.К., Шильдкраут I (1998). «Для расщепления ДНК необходима димеризация FokI» . Proc Natl Acad Sci США . 95 (18): 10570–10575. Бибкод : 1998PNAS...9510570B . дои : 10.1073/pnas.95.18.10570 . ПМК 27935 . ПМИД 9724744 .
- ^ Захран М., Дайдон И., Смит Дж. К. и Имхоф П. (2010). Механизм узнавания ДНК ферментом рестрикции EcoRV. Журнал молекулярной биологии, 401(3), 415-432.
