Не dIII
| Эндонуклеаза рестрикции HindIII | |||
|---|---|---|---|
 Кристаллографическая структура димера эндонуклеазы рестрикции HindIII (голубой и зеленый) в комплексе с двойной спиральной ДНК (коричневый) на основе координат PDB : 2E52 . | |||
| Идентификаторы | |||
| Символ | RE_Hindiii | ||
| Пфам | PF09518 | ||
| ИнтерПро | ИПР019043 | ||
| |||
| эндонуклеаза рестрикции HindIIIR типа II | |||
|---|---|---|---|
| Идентификаторы | |||
| Символ | заднийIIIR | ||
| ген NCBI | 950303 | ||
| ПДБ | 2e52 Больше структур | ||
| ЮниПрот | P43870 | ||
| Другие данные | |||
| Номер ЕС | 3.1.21.4 | ||
| |||
HindIII (произносится как «Hin D Three») представляет собой сайт-специфический фермент рестрикции дезоксирибонуклеазы типа II , выделенный из Haemophilus influenzae , который расщепляет палиндромную последовательность ДНК AAGCTT в присутствии кофактора Mg. 2+ посредством гидролиза . [1]
Расщепление этой последовательности между АК приводит к образованию 5'-выступов на ДНК, называемых липкими концами :
5'-А |AGCT Т-3'
3'-ТТСГА | А-5'
Эндонуклеазы рестрикции используются в качестве защитных механизмов у прокариотических организмов в системе модификации рестрикции . Их основная функция — защита генома хозяина от вторжения чужеродной ДНК, в первую очередь ДНК бактериофага . Есть также данные, свидетельствующие о том, что ферменты рестрикции могут действовать наряду с ферментами модификации как эгоистичные элементы или могут участвовать в генетической рекомбинации и транспозиции . [2]
Структура фермента
[ редактировать ]
Структура HindIII сложная и состоит из гомодимера. Считается, что, как и другие эндонуклеазы рестрикции типа II, она содержит общее структурное ядро, состоящее из четырех β-листов и одной α-спирали . Каждая субъединица содержит 300 аминокислот , а прогнозируемая молекулярная масса составляет 34 950 Да. Несмотря на важность этого фермента в молекулярной биологии и технологии ДНК, имеется мало информации о механизме узнавания ДНК и расщепления фосфодиэфирной связи . [1] Однако считается, что HindIII использует общий механизм распознавания и катализа ДНК, обнаруженный в других ферментах типа II EcoRI как , BamHI таких и BglII . , Эти ферменты содержат мотив аминокислотной последовательности PD-(D/E)XK для координации Mg. 2+ , катион, необходимый для расщепления ДНК в большинстве эндонуклеаз рестрикции типа II. [4] Кофактор Mg 2+ Считается, что он связывает молекулы воды и переносит их к каталитическим участкам ферментов, среди других катионов. В отличие от большинства документированных эндонуклеаз рестрикции типа II, HindIII уникален тем, что он практически не обладает каталитической активностью, когда Mg 2+ заменяется другими кофакторами, такими как Mn 2+ . [1]
Сайт-направленный мутагенез
[ редактировать ]Несмотря на неопределенность в отношении взаимосвязи структуры и катализа эндонуклеаз типа II, сайт-направленный мутагенез эндонуклеазы рестрикции HindIII позволил лучше понять ключевые вовлеченные аминокислотные остатки. В частности, замены Asn на Lys в остатке 125 и Leu на Asp в остатке 108 значительно снижают связывание ДНК и каталитическую функцию HindIII . [1] В отдельном исследовании мутагенеза было показано, что мутация по остатку 123 с Asp на Asn снижает ферментативную активность. Несмотря на то, что этот остаток, скорее всего, отвечает за раскручивание ДНК и координацию с водой, а не за прямое взаимодействие с атакующим нуклеофилом , его конкретная функция неизвестна. [4]
Предлагаемый механизм
[ редактировать ]Хотя ферменты рестрикции расщепляют определенные последовательности ДНК, им сначала необходимо неспецифически связываться с основной цепью ДНК, прежде чем локализоваться в сайте рестрикции . В среднем фермент рестрикции образует 15-20 водородных связей с основаниями последовательности узнавания. С помощью других ван-дер-ваальсовых взаимодействий эта связь способствует конформационному изменению комплекса ДНК-фермент, что приводит к активации каталитических центров. [2]
Несмотря на отсутствие доказательств, указывающих на точный механизм расщепления ДНК HindIII, анализ сайта-мутагенеза в сочетании с более детальными исследованиями катализа, опосредованного ионами металлов в Eco RV, привел к следующему предложенному каталитическому механизму. Было высказано предположение, что при гидролизе ДНК EcoRV каталитический остаток Lys-92 стабилизирует и ориентирует атакующий водный нуклеофил , а карбоксилат Asp-90 стабилизирует уходящий гидроксид- анион за счет координации Mg. 2+ . Более того, ферментативная функция зависит от правильного положения остатка Asp-74, что позволяет предположить, что он играет роль в увеличении нуклеофильности атакующей молекулы воды. [5]
В результате ранее описанных экспериментов по сайт-мутагенезу предполагается, что Lys-125, Asp-123 и Asp-108 HindIII функционируют аналогично Lys-92, Asp-90 и Asp-74 в EcoRV соответственно. . Lys-125 позиционирует атакующую молекулу воды, а Asp-108 улучшает ее нуклеофильность. Asp-123 координируется с Mg2+, который, в свою очередь, стабилизирует уходящий ион гидроксида.
Использование в исследованиях
[ редактировать ]HindIII, как и другие эндонуклеазы рестрикции типа II , очень полезны в современной науке, особенно при секвенировании и картировании ДНК . В отличие от ферментов рестрикции типа I, эндонуклеазы рестрикции типа II осуществляют очень специфическое расщепление ДНК. Ферменты рестрикции типа I распознают определенные последовательности, но расщепляют ДНК случайным образом в сайтах, отличных от их сайта узнавания, тогда как ферменты рестрикции типа II расщепляют только в своем специфическом сайте узнавания. [6] С момента своего открытия в начале 1970-х годов ферменты рестрикции типа II произвели революцию в способах работы ученых с ДНК, особенно в генной инженерии и молекулярной биологии .
Основные области применения ферментов рестрикции типа II включают анализ генов и клонирование. Они оказались идеальными системами моделирования для изучения взаимодействий белок-нуклеиновая кислота, взаимосвязей структура-функция и механизма эволюции . [2] Они делают хорошие анализы для изучения генетических мутаций благодаря своей способности специфически расщеплять ДНК, позволяя удалить или вставить ДНК. Используя ферменты рестрикции, ученые могут модифицировать, вставлять или удалять определенные гены организма , что является очень мощным инструментом, особенно когда дело касается модификации генома .
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с д Тан, Д; и др. (2000). «Мутационный анализ мутанта эндонуклеазы рестрикции-HindIII E86K с более высокой активностью и измененной специфичностью» . Белковая инженерия . 13 (4): 283–9. дои : 10.1093/белок/13.4.283 . ПМИД 10810160 .
- ^ Jump up to: а б с Пингуд, Альфред; Йельч, Альберт. (2001). «Структура и функции эндонуклеаз рестрикции II типа» . Исследования нуклеиновых кислот . 29 (18): 3705–27. дои : 10.1093/нар/29.18.3705 . ПМК 55916 . ПМИД 11557805 .
- ^ Лукач С. и др. (2000). «Понимание неизменности ферментов рестрикции: кристаллическая структура BglII и его ДНК-субстрата с разрешением 1,5 А» . Нат. Структура. Биол . 7 (2): 134–40. дои : 10.1038/72405 . ПМИД 10655616 . S2CID 20478739 .
- ^ Jump up to: а б Тан Д. и др. (1999). «Сайт-направленный мутагенез эндонуклеазы рестрикции HindIII» . Биология. Биотехнология. Биохим . 63 (10): 1703–7. дои : 10.1271/bbb.63.1703 . ПМИД 10586498 .
- ^ Хортон Н., Ньюберри К., Перона Дж. (1999). «Субстратно-опосредованный катализ, опосредованный ионами металлов, в эндонуклеазах рестрикции II типа» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 95 (23): 13489–94. дои : 10.1073/pnas.95.23.13489 . ПМК 24846 . ПМИД 9811827 .
- ^ Робертс, Ричард Дж. (2005). «Как ферменты рестрикции стали рабочими лошадками молекулярной биологии» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 102 (17): 5905–8. Бибкод : 2005PNAS..102.5905R . дои : 10.1073/pnas.0500923102 . ПМЦ 1087929 . ПМИД 15840723 .