Сборка Гибсона

Сборка Гибсона — это метод молекулярного клонирования , который позволяет соединять несколько фрагментов ДНК в одной изотермической реакции. Он назван в честь своего создателя Дэниела Дж. Гибсона, который является техническим директором и соучредителем компании синтетической биологии Telesis Bio. Эта технология более эффективна, чем ручные методы генетической рекомбинации плазмид , но остается дорогостоящей, поскольку все еще находится под патентом. ^[1]^[2]

Процесс

Вся реакция сборки Гибсона требует нескольких компонентов с небольшими манипуляциями. ^[3]

Метод позволяет одновременно объединить до 15 фрагментов ДНК на основе идентичности последовательностей. Для этого необходимо, чтобы фрагменты ДНК содержали ~20-40 пар оснований, перекрывающихся с соседними фрагментами ДНК. Эти фрагменты ДНК смешиваются с коктейлем из трех ферментов и другими буферными компонентами.

Тремя необходимыми ферментными активностями являются: экзонуклеаза , ДНК-полимераза и ДНК-лигаза .

Экзонуклеаза откусывает ДНК с 5'-конца, не ингибируя таким образом активность полимеразы и позволяя реакции протекать в одном процессе. ^[3] Образующиеся одноцепочечные области на соседних фрагментах ДНК могут отжигаться.
ДНК-полимераза включает нуклеотиды для заполнения любых пробелов.
ДНК-лигаза ковалентно соединяет ДНК соседних сегментов, тем самым удаляя любые разрывы в ДНК.

Полученный продукт представляет собой разные фрагменты ДНК, объединенные в один. Можно собрать как линейные, так и замкнутые кольцевые молекулы.

Есть два подхода к сборке Гибсона. Одноэтапный метод и двухэтапный метод. Оба метода могут быть реализованы в одном реакционном сосуде. Одноэтапный метод сборки Гибсона позволяет собирать до 5 различных фрагментов с использованием одноэтапного изотермического процесса. В этом методе фрагменты и основную смесь ферментов объединяют, и всю смесь инкубируют при 50 °C в течение одного часа. Для создания более сложных конструкций, содержащих до 15 фрагментов, или конструкций, включающих фрагменты размером от 100 п.н. до 10 т.п.н., используется двухэтапный подход сборки Гибсона. Двухэтапная реакция требует двух отдельных добавлений мастер-микса. Одна из реакций предназначена для стадии экзонуклеазы и отжига, а другая - для стадии ДНК-полимеразы и лигирования. При двухэтапном подходе для проведения процесса сборки используются разные температуры инкубации.

Преимущества

Метод сборки ДНК Гибсона имеет много преимуществ по сравнению с традиционным клонированием рекомбинантной ДНК с помощью фермента рестрикции/лигирования. Например,

Никакой рестрикционной обработки фрагментов ДНК после ПЦР не требуется. Однако основной вектор можно переварить или синтезировать с помощью ПЦР.
Это дешевле и быстрее, чем традиционные схемы клонирования, поскольку требует меньше шагов и меньше реагентов.
Между двумя фрагментами ДНК не остается рубца в месте рестрикции, но область между двойными цепями и висячими концами слегка подвержена мутациям, когда ДНК-полимераза закрывает пробелы.
До 5 фрагментов ДНК можно объединить одновременно в реакции в одной пробирке с использованием одноэтапной мастер-миксы ферментов.
Одновременно можно объединить до 15 фрагментов с помощью двухстадийной реакции. При двухэтапном подходе сначала выполняются этапы экзонуклеазы и отжига. За этим следует добавление ДНК -полимеразы и лигазы на втором этапе.
Метод сборки Гибсона также можно использовать для сайт-направленного мутагенеза для включения сайт-специфических мутаций, таких как инсерции, делеции и точковые мутации.

Ссылки

^ Гибсон, Дэниел. «Методы соединения и комбинаторной сборки молекул нуклеиновых кислот in vitro» . Гугл Патенты . Проверено 30 января 2024 г.
^ Гибсон, Дэниел. «Сборка больших нуклеиновых кислот» . Гугл Патенты . Проверено 30 января 2024 г.
^ Jump up to: ^а ^б Гибсон Д.Г., Янг Л., Чуанг Р.Ю., Вентер Дж.К., Хатчисон Калифорния (3-й), Смит Х.О. (2009). «Ферментативная сборка молекул ДНК размером до нескольких сотен килобаз». Природные методы . 6 (5): 343–345. дои : 10.1038/nmeth.1318 . ПМИД 19363495 . S2CID 1351008 .

Дополнительная информация

Руководство по сборке Гибсона от Кембриджского университета, Великобритания.
Gibson Assembly Инструмент для проектирования капсюлей
сборки Gibson Инструмент для создания праймеров для сайт-направленного мутагенеза
Химическая трансформация сборочных конструкций Гибсона
Перкель, Джеффри М. (январь 2014 г.). «Беспроблемное переписывание руководства по лабораторному клонированию» . Технические новости. БиоТехники . 56 (1): 12–14. дои : 10.2144/000114121 . ПМИД 24447134 . Гибсон говорит, что он больше даже не занимается стандартным клонированием на основе ферментов рестрикции в своей лаборатории.

[1] Гибсон, Дэниел. «Методы соединения и комбинаторной сборки молекул нуклеиновых кислот in vitro» . Гугл Патенты . Проверено 30 января 2024 г.

[2] Гибсон, Дэниел. «Сборка больших нуклеиновых кислот» . Гугл Патенты . Проверено 30 января 2024 г.

[gibson1-3] Jump up to: ^а ^б Гибсон Д.Г., Янг Л., Чуанг Р.Ю., Вентер Дж.К., Хатчисон Калифорния (3-й), Смит Х.О. (2009). «Ферментативная сборка молекул ДНК размером до нескольких сотен килобаз». Природные методы . 6 (5): 343–345. дои : 10.1038/nmeth.1318 . ПМИД 19363495 . S2CID 1351008 .

[1]

[2]

[3]