Jump to content

Восточное пятно

(Перенаправлено с Истерн-блоттинга )

Истерн -блоттинг , или истерн-блоттинг , представляет собой биохимический метод, используемый для анализа посттрансляционных модификаций белков , включая добавление липидов, фосфатов и гликоконъюгатов. Чаще всего его используют для обнаружения углеводных эпитопов . Таким образом, истерн-блоттинг можно рассматривать как расширение биохимического метода вестерн-блоттинга . Множество методов были описаны термином «восточный блоттинг (тинг)», в большинстве из них используется фосфопротеин, нанесенный из геля-электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) на поливинилиденфторидную или нитроцеллюлозную мембрану. Перенесенные белки анализируются на предмет посттрансляционных модификаций с использованием зондов, которые могут обнаруживать липиды , углеводы , фосфорилирование или любую другую модификацию белка. Истерн-блоттинг следует использовать для обозначения методов, которые обнаруживают свои цели посредством специфического взаимодействия посттрансляционных модификаций и зонда, что отличает их от стандартного дальневестерн-блоттинга . В принципе, истерн-блоттинг аналогичен лектиновый блоттинг (т.е. обнаружение углеводных эпитопов на белках или липидах). [1]

История и несколько определений

[ редактировать ]

Определение термина « восточный блоттинг» несколько запутано из-за того, что множество авторов называют новый метод « восточным блоттингом » или его производным. Все определения являются производными от метода вестерн-блоттинга, разработанного Таубином в 1979 году. [2] Текущие определения кратко изложены ниже в порядке первого использования названия; однако все они основаны на некоторых более ранних работах. В некоторых случаях этот метод применялся на практике в течение некоторого времени до введения этого термина.

  • (1982) Термин «истерн-блоттинг» был специально отвергнут двумя отдельными группами: Рейнхарт и Маламуд называли белковый блот нативного геля нативным блоттингом ; [3] Peferoen и др. решили назвать свой метод нанесения белков, разделенных гелем додецилсульфата натрия, на нитроцеллюлозу с использованием вакуума, как вакуумный блоттинг . [4] [5]
  • (1984) Ближневосточный блоттинг был описан как блоттинг полиА-РНК (разрешенной агарозой), которая затем иммобилизуется. Иммобилизованную РНК затем исследуют с помощью ДНК. [6]
  • (1996) Восточно-западный блоттинг был впервые использован Богдановым и соавт. [7] Метод включал блоттинг фосфолипидов на поливинилиденфторидной или нитроцеллюлозной мембране перед переносом белков на ту же нитроцеллюлозную мембрану с помощью обычного вестерн-блоттинга и зондирования конформационно-специфичными антителами. Этот метод основан на более ранней работе Taki et al. в 1994 году, который они первоначально назвали ТСХ-блоттингом . [8] и был основан на аналогичном методе, предложенном Таубином в 1984 году. [9]
  • (2000) Дальневосточный блоттинг, по-видимому, был впервые назван в 2000 году Исикавой и Таки. [10] Более полно метод описан в статье о дальневосточном блоттинге , но основан на окрашивании антителами или лектинами липидов, перенесенных на поливинилиденфторидные мембраны.
  • (2001) Истерн-блоттинг был описан как метод обнаружения гликоконъюгатов, образующихся путем блоттинга БСА на мембраны из поливинилиденфторида с последующей обработкой периодатом. Затем окисленный белок обрабатывают сложной смесью, образуя на мембране новый конъюгат. Затем мембрану исследуют антителами к интересующим эпитопам. [11] Этот метод также обсуждался в более поздних работах той же группы. [12] [13] Метод по существу представляет собой дальневосточный блоттинг. [14]
  • (2002) Истерн-блоттинг также использовался для описания иммуноблота, выполняемого на белках, нанесенных на поливинилиденфторидную мембрану из геля PAGE с противоположной полярностью. [15] Поскольку это, по существу, вестерн-блоттинг , обращение заряда было использовано для того, чтобы окрестить этот метод восточным блоттингом . [16] [17]
  • (2005) Истерн-блоттинг использовался для описания блоттинга белков на мембране из поливинилиденфторида, где зондом является аптамер, а не антитело. [18] Это можно рассматривать как аналог Саузерн-блоттинга , однако взаимодействие происходит между молекулой ДНК (аптамером) и белком, а не двумя молекулами ДНК. [19] Метод аналогичен юго-западному блоттингу .
  • (2006) Истерн-блоттинг использовался для обозначения обнаружения слитых белков посредством комплементации. Название основано на использовании ферментного активатора (EA) в рамках обнаружения. [20] [21] [22]
  • (2009) Истерн-блоттинг совсем недавно был переименован Томасом и др. как метод, который исследует белки, нанесенные на мембрану из поливинилиденфторида, с помощью лектинов, холерного токсина и химических красителей для обнаружения гликозилированных, липоилированных или фосфорилированных белков. [14] Эти авторы отличают метод от дальневосточного блоттинга, названного Taki et al. [10] тем, что они используют лектиновые зонды и другие красящие реагенты.
  • (2009) Истерн-блоттинг использовался для описания блоттинга белков на нитроцеллюлозной мембране, где зондом является аптамер, а не антитело. [23] Метод аналогичен юго-западному блоттингу.
  • (2011) В недавнем исследовании использовался термин истерн-блоттинг для описания обнаружения гликопротеинов с лектинами, такими как конканавалин А. [24]

Очевидно, что не существует единого общепринятого определения этого термина. Недавняя основная статья [25] взял интервью у Эда Саузерна , создателя Саузерн-блоттинга , по поводу переименования восточно-блоттинга от Танаки и др. [12] В статье восточное пятно сравнивается с «феями, единорогами и бесплатным обедом» и утверждается, что восточного пятна «не существует». Восточный блот упоминается в учебнике по иммунологии, в котором сравниваются распространенные методы блоттинга (южный, северный и западный) и утверждается, что «однако восточный блот существует только в тестовых вопросах». [26]

Принципы, используемые для истерн-блоттинга для обнаружения гликанов, восходят к использованию лектинов белков для обнаружения гликозилирования . Самый ранний пример этого способа обнаружения - Таннер и Ансти в 1976 году, где лектины использовались для обнаружения гликозилированных белков, выделенных из эритроцитов человека . [27] Специфическое обнаружение гликозилирования посредством блоттинга обычно называют лектиновым блоттингом . Краткое изложение последних улучшений протокола было предоставлено Х. Фризом. [1]

Приложения

[ редактировать ]

Одно из применений метода включает обнаружение модификаций белка у двух видов бактерий Ehrlichia - E. muris и IOE. Субъединица B холерного токсина (которая связывается с ганглиозидами ), конканавалин А (который обнаруживает маннозосодержащие гликаны) и нитрофомолибдат-метиловый зеленый (который обнаруживает фосфопротеины) были использованы для обнаружения модификаций белка. Методика показала, что антигенные белки невирулентного E.muris более посттрансляционно модифицированы, чем высоковирулентный IOE. [14]

Значение

[ редактировать ]

Большинство белков , которые транслируются с мРНК, подвергаются модификациям, прежде чем стать функциональными в клетках. Эти модификации известны под общим названием посттрансляционные модификации . Возникающие или свернутые белки, которые стабильны в физиологических условиях, затем подвергаются множеству специфических ферментативно-катализируемых модификаций боковых цепей или остовов.

Посттрансляционная модификация белков может включать ацетилирование , ацилирование ( миристоилирование , пальмитоилирование ), алкилирование , аргинилирование , АДФ-рибозилирование , биотинилирование , формилирование , геранилгеранилирование , гликозилирование , гликирование , гидроксилирование , изопренилирование , липоилирование , метилирование , глутамилирование , нитроалкилирование фосфорилирование , тетеинилирование фосфопана. , пренилирование , селенирование , S-нитрозилирование , сукцинилирование , сульфатирование , трансглутаминирование , сульфинилирование , сульфонилирование и убиквитинирование (сумойлирование, неддилирование). [28] [29]

Посттрансляционные модификации, происходящие на N-конце цепи, аминокислотной играют важную роль в транслокации через биологические мембраны. К ним относятся секреторные белки прокариот и эукариот , а также белки, которые предназначены для включения в различные клеточные и органелльные мембраны, такие как лизосомы , хлоропласты , митохондрии и плазматические мембраны . Экспрессия посттранслируемых белков важна при ряде заболеваний.

См. также

[ редактировать ]
  1. ^ Jump up to: а б Фриз, Х.Х. (1993). «Приготовление и анализ гликоконъюгатов». Современные протоколы молекулярной биологии . Глава 17: 17.7.1–17.7.8. дои : 10.1002/0471142727.mb1707s23 . ПМИД   18265163 . S2CID   205153650 .
  2. ^ Таубин; Штелин, Т; Гордон, Дж; и др. (1979). «Электрофоретический перенос белков из полиакриламидных гелей на листы нитроцеллюлозы: методика и некоторые применения» . ПНАС . 76 (9): 4350–4. Бибкод : 1979PNAS...76.4350T . дои : 10.1073/pnas.76.9.4350 . ПМК   411572 . ПМИД   388439 .
  3. ^ Рейнхарт и Маламуд; Маламуд, Д. (1982). «Перенос белка из изоэлектрофокусирующих гелей: нативный блот». Аналитическая биохимия . 123 (2): 229–235. дои : 10.1016/0003-2697(82)90439-0 . ПМИД   6181706 .
  4. ^ Пефероен; и др. (1982). «Вакуум-блоттинг: новый простой и эффективный перенос белков из додецилсульфатно-полиакриламидных гелей натрия в нитроцеллюлозу» . Письма ФЭБС . 145 (2): 369–372. Бибкод : 1982FEBSL.145..369P . дои : 10.1016/0014-5793(82)80202-0 . S2CID   85394990 .
  5. ^ Рокко, Р.М., изд. (2005). Знаковые статьи по клинической химии . Эльзевир Наука. п. 385 . ISBN  978-0-444-51950-4 .
  6. ^ Решнер, Д.Х.; Герцберг, М. (1984). «Новая среда для блоттинга для простого выделения и идентификации высокоразрешенной информационной РНК» . Исследования нуклеиновых кислот . 12 (3): 1349–1359. дои : 10.1093/нар/12.3.1349 . ПМК   318581 . ПМИД   6701087 .
  7. ^ Богданов; Сан, Дж; Кабак, HR; Доухан, В; и др. (1996). «Фосфолипид действует как шаперон при сборке мембранного транспортного белка» . Журнал биологической химии . 271 (20): 11615–11618. дои : 10.1074/jbc.271.20.11615 . ПМИД   8662750 .
  8. ^ Таки; Ханда, С; Исикава, Д; и др. (1994). «Блоттинг гликолипидов и фосфолипидов с высокоэффективной тонкослойной хроматограммы на мембрану из поливинилидендифторида». Аналитическая биохимия . 221 (2): 312–316. дои : 10.1006/abio.1994.1418 . ПМИД   7810872 .
  9. ^ Таубин; Шёненбергер, К; Болл, Р; Браун, Д.Г.; Розенфельдер, Г; и др. (1984). «Гликосфинголипид-блоттинг: процедура иммунологического обнаружения после разделения с помощью тонкослойной хроматографии». Журнал иммунологических методов . 72 (2): 471–9. дои : 10.1016/0022-1759(84)90015-2 . ПМИД   6381603 .
  10. ^ Jump up to: а б Исикава и Таки; Таки, Т (2000). «Тонкослойная хроматография-блоттинг с использованием поливинилидендифторидной мембраны (дальневосточный блоттинг) и ее применение». Метаболизм сфинголипидов и передача сигналов в клетках, Часть B. Методы энзимологии. Том. 312. стр. 145–57. дои : 10.1016/S0076-6879(00)12905-2 . ISBN  9780121822132 . ПМИД   11070868 .
  11. ^ Шан; Танака, Х; Сёяма, Ю; и др. (2001). «Имуноферментный анализ глицирризина с использованием моноклональных антител к глицирризину и новый истерн-блоттинг глюкуронидов глицирретиновой кислоты». Аналитическая химия . 73 (24): 5784–90. дои : 10.1021/ac0106997 . ПМИД   11791545 .
  12. ^ Jump up to: а б Танака; Фукуда, Н.; Сёяма, Ю; и др. (2007). «Истерн-блоттинг и иммуноаффинная концентрация с использованием моноклональных антител к сапонинам женьшеня в области традиционной китайской медицины». Журнал сельскохозяйственной и пищевой химии . 55 (10): 3783–7. дои : 10.1021/jf063457m . ПМИД   17455950 .
  13. ^ Фукуда; Шан, Шаоцзе; Танака, Хироюки; Сёяма, Юкихиро; и др. (2006). «Новая методология окрашивания: Истерн-блоттинг гликозидов в области лагерных лекарств». Журнал натуральных лекарств . 60 : 21–27. дои : 10.1007/ s11418-005-0005-3 S2CID   44234050 .
  14. ^ Jump up to: а б с Томас; Тирумалапура, Н.; Кроссли, ЕС; Исмаил, Н.; Уокер, Д.Х.; и др. (2009). «Модификации антигенных белков при эрлихиях» . Иммунология паразитов . 31 (6): 296–303. дои : 10.1111/j.1365-3024.2009.01099.x . ПМЦ   2731653 . ПМИД   19493209 .
  15. ^ Буксбаум; и др. (2002). «Катионный электрофорез и электроперенос мембранных гликопротеинов». Аналитическая биохимия . 314 (1): 70–76. дои : 10.1016/S0003-2697(02)00639-5 . ПМИД   12633604 .
  16. ^ Куриен и Скофилд; Скофилд, Р.Х. (2006). «Вестерн-блоттинг». Методы . 38 (4): 283–293. дои : 10.1016/j.ymeth.2005.11.007 . ПМИД   16483794 .
  17. ^ Буксбаум (2009). «Катионный электрофорез и Истерн-блоттинг». Блоттинг и обнаружение белков . Методы молекулярной биологии. Том. 536. С. 115–128. дои : 10.1007/978-1-59745-542-8_14 . ISBN  978-1-934115-73-2 . ПМИД   19378051 .
  18. ^ Лека-Бувье и Блюм; Блюм, Лоик (2005). «Биосенсоры для обнаружения белков: обзор». Аналитические письма . 38 (10): 1491. doi : 10.1081/AL-200065780 . S2CID   94503772 .
  19. ^ Джаясена (1999). «Аптамеры: новый класс молекул, конкурирующих с антителами в диагностике» . Клиническая химия . 45 (9): 1628–1650. дои : 10.1093/клинчем/45.9.1628 . ПМИД   10471678 .
  20. ^ Горецка; Чартер, Северо-Запад; Босано, БЛ; Фунг, П; Кобель, П; Пэн, К; Эглен, РМ; и др. (2006). «Новый метод блоттинга белков без антител с использованием комплементации фрагментов ферментов» . БиоТехники . 40 (3): 381–383. дои : 10.2144/000112119 . PMID   16568826 .
  21. ^ Олсон и Эглен; Эглен, РМ (2007). «Комплементация бета-галактозидазы: платформа клеточного люминесцентного анализа для открытия лекарств». АНАЛИЗА и технологии разработки лекарств . 5 (1): 137–144. дои : 10.1089/adt.2006.052 . ПМИД   17355206 .
  22. Коммерчески доступные наборы для восточного блоттинга. Архивировано 5 сентября 2009 г. в Wayback Machine.
  23. ^ Лин и МакНэтти; Лин, Дж. С. (2009). «Регионально защищенная ПЦР на основе аптамеров для обнаружения белков» . Клиническая химия . 55 (9): 1687–1693. дои : 10.1373/clinchem.2009.127266 . ПМИД   19589846 .
  24. ^ Мариаппа Д., Зауэрт К., Мариньо К., Тернок Д., Вебстер Р., ван Алтен Д.М., Фергюсон М.А., Мюллер Х.А. Белок O-GlcNAcylation необходим для передачи сигналов фактора роста фибробластов у Drosophila.Sci Signal. 20 декабря 2011 г.;4(204) ra89. http://davapc1.bioch.dundee.ac.uk/pdf/nesthocker.pdf
  25. ^ Восточное пятно на пейзаже
  26. ^ Люттман, Братке и Куппер (2006). Иммунология . Академическая пресса. п. 11. ISBN  978-0-12-088544-2 .
  27. ^ Таннер, MJ; Ансти, диджей (1976). «Метод прямой демонстрации лектинсвязывающих компонентов мембраны эритроцитов человека» . Биохимический журнал . 153 (2): 265–270. дои : 10.1042/bj1530265 . ПМЦ   1172571 . ПМИД   1275889 .
  28. ^ Манн, М; Дженсен, Онтарио (2003). «Протеомный анализ посттрансляционных модификаций». Природная биотехнология . 21 (3): 255–261. дои : 10.1038/nbt0303-255 . ПМИД   12610572 . S2CID   205266061 .
  29. ^ Уолш, Коннектикут; Гарно-Цодикова, С ; Гатто, Джи-Джей-младший (2005). «Посттрансляционные модификации белков: химия диверсификации протеома». Angewandte Chemie International Edition на английском языке . 44 (45): 7342–7372. дои : 10.1002/anie.200501023 . ПМИД   16267872 . S2CID   32157563 .
Arc.Ask3.Ru: конец переведенного документа.
Arc.Ask3.Ru
Номер скриншота №: 0db10c6bfaab6a1fb0857f8ecf3c6d18__1719008220
URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/0d/18/0db10c6bfaab6a1fb0857f8ecf3c6d18.html
Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1:
Eastern blot - Wikipedia
Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)