Восточное пятно
Истерн -блоттинг , или истерн-блоттинг , представляет собой биохимический метод, используемый для анализа посттрансляционных модификаций белков , включая добавление липидов, фосфатов и гликоконъюгатов. Чаще всего его используют для обнаружения углеводных эпитопов . Таким образом, истерн-блоттинг можно рассматривать как расширение биохимического метода вестерн-блоттинга . Множество методов были описаны термином «восточный блоттинг (тинг)», в большинстве из них используется фосфопротеин, нанесенный из геля-электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) на поливинилиденфторидную или нитроцеллюлозную мембрану. Перенесенные белки анализируются на предмет посттрансляционных модификаций с использованием зондов, которые могут обнаруживать липиды , углеводы , фосфорилирование или любую другую модификацию белка. Истерн-блоттинг следует использовать для обозначения методов, которые обнаруживают свои цели посредством специфического взаимодействия посттрансляционных модификаций и зонда, что отличает их от стандартного дальневестерн-блоттинга . В принципе, истерн-блоттинг аналогичен лектиновый блоттинг (т.е. обнаружение углеводных эпитопов на белках или липидах). [1]
История и несколько определений
[ редактировать ]Определение термина « восточный блоттинг» несколько запутано из-за того, что множество авторов называют новый метод « восточным блоттингом » или его производным. Все определения являются производными от метода вестерн-блоттинга, разработанного Таубином в 1979 году. [2] Текущие определения кратко изложены ниже в порядке первого использования названия; однако все они основаны на некоторых более ранних работах. В некоторых случаях этот метод применялся на практике в течение некоторого времени до введения этого термина.
- (1982) Термин «истерн-блоттинг» был специально отвергнут двумя отдельными группами: Рейнхарт и Маламуд называли белковый блот нативного геля нативным блоттингом ; [3] Peferoen и др. решили назвать свой метод нанесения белков, разделенных гелем додецилсульфата натрия, на нитроцеллюлозу с использованием вакуума, как вакуумный блоттинг . [4] [5]
- (1984) Ближневосточный блоттинг был описан как блоттинг полиА-РНК (разрешенной агарозой), которая затем иммобилизуется. Иммобилизованную РНК затем исследуют с помощью ДНК. [6]
- (1996) Восточно-западный блоттинг был впервые использован Богдановым и соавт. [7] Метод включал блоттинг фосфолипидов на поливинилиденфторидной или нитроцеллюлозной мембране перед переносом белков на ту же нитроцеллюлозную мембрану с помощью обычного вестерн-блоттинга и зондирования конформационно-специфичными антителами. Этот метод основан на более ранней работе Taki et al. в 1994 году, который они первоначально назвали ТСХ-блоттингом . [8] и был основан на аналогичном методе, предложенном Таубином в 1984 году. [9]
- (2000) Дальневосточный блоттинг, по-видимому, был впервые назван в 2000 году Исикавой и Таки. [10] Более полно метод описан в статье о дальневосточном блоттинге , но основан на окрашивании антителами или лектинами липидов, перенесенных на поливинилиденфторидные мембраны.
- (2001) Истерн-блоттинг был описан как метод обнаружения гликоконъюгатов, образующихся путем блоттинга БСА на мембраны из поливинилиденфторида с последующей обработкой периодатом. Затем окисленный белок обрабатывают сложной смесью, образуя на мембране новый конъюгат. Затем мембрану исследуют антителами к интересующим эпитопам. [11] Этот метод также обсуждался в более поздних работах той же группы. [12] [13] Метод по существу представляет собой дальневосточный блоттинг. [14]
- (2002) Истерн-блоттинг также использовался для описания иммуноблота, выполняемого на белках, нанесенных на поливинилиденфторидную мембрану из геля PAGE с противоположной полярностью. [15] Поскольку это, по существу, вестерн-блоттинг , обращение заряда было использовано для того, чтобы окрестить этот метод восточным блоттингом . [16] [17]
- (2005) Истерн-блоттинг использовался для описания блоттинга белков на мембране из поливинилиденфторида, где зондом является аптамер, а не антитело. [18] Это можно рассматривать как аналог Саузерн-блоттинга , однако взаимодействие происходит между молекулой ДНК (аптамером) и белком, а не двумя молекулами ДНК. [19] Метод аналогичен юго-западному блоттингу .
- (2006) Истерн-блоттинг использовался для обозначения обнаружения слитых белков посредством комплементации. Название основано на использовании ферментного активатора (EA) в рамках обнаружения. [20] [21] [22]
- (2009) Истерн-блоттинг совсем недавно был переименован Томасом и др. как метод, который исследует белки, нанесенные на мембрану из поливинилиденфторида, с помощью лектинов, холерного токсина и химических красителей для обнаружения гликозилированных, липоилированных или фосфорилированных белков. [14] Эти авторы отличают метод от дальневосточного блоттинга, названного Taki et al. [10] тем, что они используют лектиновые зонды и другие красящие реагенты.
- (2009) Истерн-блоттинг использовался для описания блоттинга белков на нитроцеллюлозной мембране, где зондом является аптамер, а не антитело. [23] Метод аналогичен юго-западному блоттингу.
- (2011) В недавнем исследовании использовался термин истерн-блоттинг для описания обнаружения гликопротеинов с лектинами, такими как конканавалин А. [24]
Очевидно, что не существует единого общепринятого определения этого термина. Недавняя основная статья [25] взял интервью у Эда Саузерна , создателя Саузерн-блоттинга , по поводу переименования восточно-блоттинга от Танаки и др. [12] В статье восточное пятно сравнивается с «феями, единорогами и бесплатным обедом» и утверждается, что восточного пятна «не существует». Восточный блот упоминается в учебнике по иммунологии, в котором сравниваются распространенные методы блоттинга (южный, северный и западный) и утверждается, что «однако восточный блот существует только в тестовых вопросах». [26]
Принципы, используемые для истерн-блоттинга для обнаружения гликанов, восходят к использованию лектинов белков для обнаружения гликозилирования . Самый ранний пример этого способа обнаружения - Таннер и Ансти в 1976 году, где лектины использовались для обнаружения гликозилированных белков, выделенных из эритроцитов человека . [27] Специфическое обнаружение гликозилирования посредством блоттинга обычно называют лектиновым блоттингом . Краткое изложение последних улучшений протокола было предоставлено Х. Фризом. [1]
Приложения
[ редактировать ]Одно из применений метода включает обнаружение модификаций белка у двух видов бактерий Ehrlichia - E. muris и IOE. Субъединица B холерного токсина (которая связывается с ганглиозидами ), конканавалин А (который обнаруживает маннозосодержащие гликаны) и нитрофомолибдат-метиловый зеленый (который обнаруживает фосфопротеины) были использованы для обнаружения модификаций белка. Методика показала, что антигенные белки невирулентного E.muris более посттрансляционно модифицированы, чем высоковирулентный IOE. [14]
Значение
[ редактировать ]Большинство белков , которые транслируются с мРНК, подвергаются модификациям, прежде чем стать функциональными в клетках. Эти модификации известны под общим названием посттрансляционные модификации . Возникающие или свернутые белки, которые стабильны в физиологических условиях, затем подвергаются множеству специфических ферментативно-катализируемых модификаций боковых цепей или остовов.
Посттрансляционная модификация белков может включать ацетилирование , ацилирование ( миристоилирование , пальмитоилирование ), алкилирование , аргинилирование , АДФ-рибозилирование , биотинилирование , формилирование , геранилгеранилирование , гликозилирование , гликирование , гидроксилирование , изопренилирование , липоилирование , метилирование , глутамилирование , нитроалкилирование фосфорилирование , тетеинилирование фосфопана. , пренилирование , селенирование , S-нитрозилирование , сукцинилирование , сульфатирование , трансглутаминирование , сульфинилирование , сульфонилирование и убиквитинирование (сумойлирование, неддилирование). [28] [29]
Посттрансляционные модификации, происходящие на N-конце цепи, аминокислотной играют важную роль в транслокации через биологические мембраны. К ним относятся секреторные белки прокариот и эукариот , а также белки, которые предназначены для включения в различные клеточные и органелльные мембраны, такие как лизосомы , хлоропласты , митохондрии и плазматические мембраны . Экспрессия посттранслируемых белков важна при ряде заболеваний.
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б Фриз, Х.Х. (1993). «Приготовление и анализ гликоконъюгатов». Современные протоколы молекулярной биологии . Глава 17: 17.7.1–17.7.8. дои : 10.1002/0471142727.mb1707s23 . ПМИД 18265163 . S2CID 205153650 .
- ^ Таубин; Штелин, Т; Гордон, Дж; и др. (1979). «Электрофоретический перенос белков из полиакриламидных гелей на листы нитроцеллюлозы: методика и некоторые применения» . ПНАС . 76 (9): 4350–4. Бибкод : 1979PNAS...76.4350T . дои : 10.1073/pnas.76.9.4350 . ПМК 411572 . ПМИД 388439 .
- ^ Рейнхарт и Маламуд; Маламуд, Д. (1982). «Перенос белка из изоэлектрофокусирующих гелей: нативный блот». Аналитическая биохимия . 123 (2): 229–235. дои : 10.1016/0003-2697(82)90439-0 . ПМИД 6181706 .
- ^ Пефероен; и др. (1982). «Вакуум-блоттинг: новый простой и эффективный перенос белков из додецилсульфатно-полиакриламидных гелей натрия в нитроцеллюлозу» . Письма ФЭБС . 145 (2): 369–372. Бибкод : 1982FEBSL.145..369P . дои : 10.1016/0014-5793(82)80202-0 . S2CID 85394990 .
- ^ Рокко, Р.М., изд. (2005). Знаковые статьи по клинической химии . Эльзевир Наука. п. 385 . ISBN 978-0-444-51950-4 .
- ^ Решнер, Д.Х.; Герцберг, М. (1984). «Новая среда для блоттинга для простого выделения и идентификации высокоразрешенной информационной РНК» . Исследования нуклеиновых кислот . 12 (3): 1349–1359. дои : 10.1093/нар/12.3.1349 . ПМК 318581 . ПМИД 6701087 .
- ^ Богданов; Сан, Дж; Кабак, HR; Доухан, В; и др. (1996). «Фосфолипид действует как шаперон при сборке мембранного транспортного белка» . Журнал биологической химии . 271 (20): 11615–11618. дои : 10.1074/jbc.271.20.11615 . ПМИД 8662750 .
- ^ Таки; Ханда, С; Исикава, Д; и др. (1994). «Блоттинг гликолипидов и фосфолипидов с высокоэффективной тонкослойной хроматограммы на мембрану из поливинилидендифторида». Аналитическая биохимия . 221 (2): 312–316. дои : 10.1006/abio.1994.1418 . ПМИД 7810872 .
- ^ Таубин; Шёненбергер, К; Болл, Р; Браун, Д.Г.; Розенфельдер, Г; и др. (1984). «Гликосфинголипид-блоттинг: процедура иммунологического обнаружения после разделения с помощью тонкослойной хроматографии». Журнал иммунологических методов . 72 (2): 471–9. дои : 10.1016/0022-1759(84)90015-2 . ПМИД 6381603 .
- ^ Jump up to: а б Исикава и Таки; Таки, Т (2000). «Тонкослойная хроматография-блоттинг с использованием поливинилидендифторидной мембраны (дальневосточный блоттинг) и ее применение». Метаболизм сфинголипидов и передача сигналов в клетках, Часть B. Методы энзимологии. Том. 312. стр. 145–57. дои : 10.1016/S0076-6879(00)12905-2 . ISBN 9780121822132 . ПМИД 11070868 .
- ^ Шан; Танака, Х; Сёяма, Ю; и др. (2001). «Имуноферментный анализ глицирризина с использованием моноклональных антител к глицирризину и новый истерн-блоттинг глюкуронидов глицирретиновой кислоты». Аналитическая химия . 73 (24): 5784–90. дои : 10.1021/ac0106997 . ПМИД 11791545 .
- ^ Jump up to: а б Танака; Фукуда, Н.; Сёяма, Ю; и др. (2007). «Истерн-блоттинг и иммуноаффинная концентрация с использованием моноклональных антител к сапонинам женьшеня в области традиционной китайской медицины». Журнал сельскохозяйственной и пищевой химии . 55 (10): 3783–7. дои : 10.1021/jf063457m . ПМИД 17455950 .
- ^ Фукуда; Шан, Шаоцзе; Танака, Хироюки; Сёяма, Юкихиро; и др. (2006). «Новая методология окрашивания: Истерн-блоттинг гликозидов в области лагерных лекарств». Журнал натуральных лекарств . 60 : 21–27. дои : 10.1007/ s11418-005-0005-3 S2CID 44234050 .
- ^ Jump up to: а б с Томас; Тирумалапура, Н.; Кроссли, ЕС; Исмаил, Н.; Уокер, Д.Х.; и др. (2009). «Модификации антигенных белков при эрлихиях» . Иммунология паразитов . 31 (6): 296–303. дои : 10.1111/j.1365-3024.2009.01099.x . ПМЦ 2731653 . ПМИД 19493209 .
- ^ Буксбаум; и др. (2002). «Катионный электрофорез и электроперенос мембранных гликопротеинов». Аналитическая биохимия . 314 (1): 70–76. дои : 10.1016/S0003-2697(02)00639-5 . ПМИД 12633604 .
- ^ Куриен и Скофилд; Скофилд, Р.Х. (2006). «Вестерн-блоттинг». Методы . 38 (4): 283–293. дои : 10.1016/j.ymeth.2005.11.007 . ПМИД 16483794 .
- ^ Буксбаум (2009). «Катионный электрофорез и Истерн-блоттинг». Блоттинг и обнаружение белков . Методы молекулярной биологии. Том. 536. С. 115–128. дои : 10.1007/978-1-59745-542-8_14 . ISBN 978-1-934115-73-2 . ПМИД 19378051 .
- ^ Лека-Бувье и Блюм; Блюм, Лоик (2005). «Биосенсоры для обнаружения белков: обзор». Аналитические письма . 38 (10): 1491. doi : 10.1081/AL-200065780 . S2CID 94503772 .
- ^ Джаясена (1999). «Аптамеры: новый класс молекул, конкурирующих с антителами в диагностике» . Клиническая химия . 45 (9): 1628–1650. дои : 10.1093/клинчем/45.9.1628 . ПМИД 10471678 .
- ^ Горецка; Чартер, Северо-Запад; Босано, БЛ; Фунг, П; Кобель, П; Пэн, К; Эглен, РМ; и др. (2006). «Новый метод блоттинга белков без антител с использованием комплементации фрагментов ферментов» . БиоТехники . 40 (3): 381–383. дои : 10.2144/000112119 . PMID 16568826 .
- ^ Олсон и Эглен; Эглен, РМ (2007). «Комплементация бета-галактозидазы: платформа клеточного люминесцентного анализа для открытия лекарств». АНАЛИЗА и технологии разработки лекарств . 5 (1): 137–144. дои : 10.1089/adt.2006.052 . ПМИД 17355206 .
- ↑ Коммерчески доступные наборы для восточного блоттинга. Архивировано 5 сентября 2009 г. в Wayback Machine.
- ^ Лин и МакНэтти; Лин, Дж. С. (2009). «Регионально защищенная ПЦР на основе аптамеров для обнаружения белков» . Клиническая химия . 55 (9): 1687–1693. дои : 10.1373/clinchem.2009.127266 . ПМИД 19589846 .
- ^ Мариаппа Д., Зауэрт К., Мариньо К., Тернок Д., Вебстер Р., ван Алтен Д.М., Фергюсон М.А., Мюллер Х.А. Белок O-GlcNAcylation необходим для передачи сигналов фактора роста фибробластов у Drosophila.Sci Signal. 20 декабря 2011 г.;4(204) ra89. http://davapc1.bioch.dundee.ac.uk/pdf/nesthocker.pdf
- ^ Восточное пятно на пейзаже
- ^ Люттман, Братке и Куппер (2006). Иммунология . Академическая пресса. п. 11. ISBN 978-0-12-088544-2 .
- ^ Таннер, MJ; Ансти, диджей (1976). «Метод прямой демонстрации лектинсвязывающих компонентов мембраны эритроцитов человека» . Биохимический журнал . 153 (2): 265–270. дои : 10.1042/bj1530265 . ПМЦ 1172571 . ПМИД 1275889 .
- ^ Манн, М; Дженсен, Онтарио (2003). «Протеомный анализ посттрансляционных модификаций». Природная биотехнология . 21 (3): 255–261. дои : 10.1038/nbt0303-255 . ПМИД 12610572 . S2CID 205266061 .
- ^ Уолш, Коннектикут; Гарно-Цодикова, С ; Гатто, Джи-Джей-младший (2005). «Посттрансляционные модификации белков: химия диверсификации протеома». Angewandte Chemie International Edition на английском языке . 44 (45): 7342–7372. дои : 10.1002/anie.200501023 . ПМИД 16267872 . S2CID 32157563 .