Идентификация ДНК-аденин-метилтрансферазы
Идентификация ДНК-аденин-метилтрансферазы , часто сокращенно DamID , [1] представляет собой протокол молекулярной биологии, используемый для картирования сайтов связывания ДНК- и хроматин -связывающих белков у эукариот . DamID идентифицирует сайты связывания путем экспрессии предполагаемого ДНК-связывающего белка в виде слитого белка с ДНК-метилтрансферазой . Связывание интересующего белка с ДНК локализует метилтрансферазу в области сайта связывания. Метилирование аденина не происходит в природе у эукариот, и поэтому можно сделать вывод, что метилирование аденина в любой области было вызвано слитым белком, подразумевая, что эта область расположена рядом с сайтом связывания. DamID — это альтернативный метод ChIP-on-chip или ChIP-seq . [2]
Описание
[ редактировать ]Принцип
[ редактировать ]
N6-метиладенин (m6A) представляет собой продукт присоединения метильной группы (CH 3 ) в положении 6 аденина. Этот модифицированный нуклеотид отсутствует у подавляющего большинства эукариот, за исключением C. elegans . [3] но широко распространен в бактериальных геномах, [4] как часть систем рестрикционной модификации или репарации ДНК . У Escherichia coli метилирование аденина катализируется аденин-метилтрансферазой Dam (ДНК-аденин-метилтрансфераза), которая катализирует метилирование аденина исключительно в палиндромной последовательности GATC. Эктопическая экспрессия Dam в эукариотических клетках приводит к метилированию аденина в последовательностях GATC без какого-либо другого заметного побочного эффекта.
Исходя из этого, DamID заключается в слиянии Dam с интересующим белком (обычно белком, который взаимодействует с ДНК, например факторами транскрипции ) или компонентом хроматина. Таким образом, представляющий интерес белок нацеливает Dam на родственный сайт связывания in vivo , что приводит к метилированию соседних GATC. Присутствие m6A, совпадающего с сайтами связывания интересующих белков, выявляют с помощью метил-ПЦР .
Метил ПЦР
[ редактировать ]В этом анализе геном расщепляется DpnI , который разрезает только метилированные GATC. Затем двухцепочечные адаптеры с известной последовательностью лигируют к концам, генерируемым DpnI. Продукты лигирования затем перевариваются DpnII . Этот фермент разрезает неметилированные GATC, гарантируя, что только фрагменты, фланкированные последовательными в последующей ПЦР амплифицируются метилированными GATC. Затем проводится ПЦР с праймерами, соответствующими адаптерам, что приводит к специфической амплификации геномных фрагментов, фланкированных метилированными GATC.
Специфика DamID по сравнению с иммунопреципитацией хроматина
[ редактировать ]Иммунопреципитация хроматина , или (ChIP), является альтернативным методом анализа связывания белка в определенных локусах генома. В отличие от ChIP, DamID не требует специфических антител против интересующего белка. С одной стороны, это позволяет картировать белки, к которым таких антител нет. С другой стороны, это делает невозможным специфическое картирование посттрансляционно модифицированных белков.
Еще одно фундаментальное отличие заключается в том, что ChIP анализирует, где интересующий белок находится в данный момент, тогда как DamID анализирует, где он был . Причина в том, что m6A остается в ДНК после того, как слитый белок Dam исчезает. Для белков, которые либо связаны, либо несвязаны со своими сайтами-мишенями, это не меняет общей картины. Однако это может привести к сильным различиям в случае белков, скользящих по ДНК ( например, РНК-полимеразы).
Известные предубеждения и технические проблемы
[ редактировать ]Смещение метилирования плазмиды
[ редактировать ]В зависимости от того, как проводится эксперимент, DamID может подвергаться систематической ошибке метилирования плазмиды. Поскольку плазмиды обычно амплифицируются в E. coli , где Dam естественным образом экспрессируется, они метилируются на каждом GATC. В экспериментах по временной трансфекции ДНК этих плазмид восстанавливается вместе с ДНК трансфицированных клеток, а это означает, что фрагменты плазмиды амплифицируются в метил-ПЦР. Таким образом, каждая последовательность генома, имеющая гомологию или идентичность с плазмидой, может оказаться связанной с интересующим белком. В частности, это справедливо в отношении открытой рамки считывания интересующего белка, которая присутствует как в плазмиде, так и в геноме. В экспериментах на микрочипах это смещение можно использовать для обеспечения гибридизации правильного материала. В стабильных клеточных линиях или полностью трансгенных животных эта ошибка не наблюдается, поскольку плазмидная ДНК не восстанавливается.
Апоптоз
[ редактировать ]Апоптозные клетки разрушают свою ДНК по характерной схеме нуклеосомной лестницы. При этом образуются фрагменты ДНК, которые можно лигировать и амплифицировать во время процедуры DamID (лаборатория Ван Стинселя, неопубликованные наблюдения). Влияние этих нуклеосомных фрагментов на профиль связывания белка неизвестно.
Разрешение
[ редактировать ]Разрешение DamID зависит от наличия последовательностей GATC в геноме. Белок может быть картирован только в пределах двух последовательных сайтов GATC. Среднее расстояние между фрагментами GATC составляет 205 п.н. у дрозофилы (выпуск 5 FlyBase), 260 у мыши (Mm9) и 460 у человека (HG19). Модифицированный протокол (DamIP), который сочетает в себе иммунопреципитацию m6A с вариантом Dam с менее специфичным распознаванием целевого сайта, может использоваться для получения данных с более высоким разрешением. [5]
Методы, специфичные для типов клеток
[ редактировать ]Основным преимуществом DamID перед ChIP seq является то, что профилирование сайтов связывания белков можно анализировать в определенном типе клеток in vivo, не требуя физического разделения субпопуляции клеток. Это позволяет исследовать процессы развития или физиологические процессы на животных моделях.
Целевой DamID
[ редактировать ]Целевой подход DamID (TaDa) использует явление повторной инициации рибосом для экспрессии белков слияния Dam на достаточно низких уровнях для DamID (т.е. Dam ненасыщает, что позволяет избежать токсичности). Эту конструкцию можно комбинировать со специфичными для конкретного типа клеток промоторами, что приводит к тканеспецифичному метилированию. [6] [7] Этот подход можно использовать для анализа связывания фактора транскрипции в интересующем типе клеток или, альтернативно, dam можно слить с субъединицами Pol II , чтобы определить связывание РНК-полимеразы и, таким образом, сделать вывод об экспрессии генов, специфичных для клеток. Целевой DamID был продемонстрирован на дрозофиле и мышах. [8] [9] клетки.
FRT/FLP-выход DamID
[ редактировать ]Специфического для клеток DamID также можно достичь с помощью рекомбинационно -опосредованного вырезания кассеты терминатора транскрипции , расположенной выше слитого белка Dam. [10] Кассета терминатора фланкирована сайтами рекомбинации FRT, которые могут быть удалены в сочетании с тканеспецифической экспрессией рекомбиназы FLP . После удаления кассеты Dam-fusion экспрессируется на низких уровнях под контролем базального промотора.
Варианты
[ редактировать ]Помимо обнаружения стандартных взаимодействий белок-ДНК, DamID можно использовать для исследования других аспектов биологии хроматина.
Разделенная плотинаID
[ редактировать ]Этот метод можно использовать для обнаружения совместного связывания двух факторов с одним и тем же геномным локусом . Метилаза Dam может экспрессироваться в виде двух половин, которые слиты с различными представляющими интерес белками. Когда оба белка связываются с одним и тем же участком ДНК, фермент Dam восстанавливается и способен метилировать окружающие сайты GATC. [11]
Доступность хроматина
[ редактировать ]Благодаря высокой активности фермента экспрессия несвязанного Dam приводит к метилированию всех участков доступного хроматина. [12] [13] Этот подход можно использовать в качестве альтернативы ATAC-seq или DNAse-seq . В сочетании с методами DamID, специфичными для конкретного типа клеток, экспрессия несвязанного Dam может быть использована для идентификации областей промотора или энхансера, специфичных для конкретного типа клеток.
Взаимодействие РНК-ДНК
[ редактировать ]Вариант DamID, известный как RNA-DamID, можно использовать для обнаружения взаимодействий между молекулами РНК и ДНК. [14] Этот метод основан на экспрессии слитого белка Dam-MCP, который способен связываться с РНК, модифицированной с помощью MS2 стволовых петель . Связывание белка Dam-слияния с РНК приводит к обнаруживаемому метилированию в сайтах связывания РНК с геномом.
Долгосрочные регуляторные взаимодействия
[ редактировать ]Последовательности ДНК, дистальные от сайта связывания белка, могут быть физически сближены за счет образования петель хромосом. Например, такие взаимодействия опосредуют функцию энхансера и промотора . Эти взаимодействия можно обнаружить по действию метилирования Dam. Если Dam нацелен на конкретный известный локус ДНК, дистальные участки, находящиеся рядом из-за трехмерной конфигурации ДНК, также будут метилированы и могут быть обнаружены, как и в обычном DamID. [15]
DamID для одной ячейки
[ редактировать ]DamID обычно выполняется примерно на 10 000 ячеек. [16] (хотя это было продемонстрировано с меньшим количеством [6] ). Это означает, что полученные данные представляют собой среднее связывание или вероятность события связывания в этой популяции клеток. Протокол DamID для отдельных клеток также был разработан и применен к клеткам человека. [17] Подходы к отдельным клеткам могут подчеркнуть гетерогенность ассоциаций хроматина между клетками.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ ван Стинсел Б., Хеникофф С. (апрель 2000 г.). «Идентификация in vivo ДНК-мишеней белков хроматина с использованием привязанной метилтрансферазы плотины». Природная биотехнология . 18 (4): 424–8. дои : 10.1038/74487 . ПМИД 10748524 . S2CID 30350384 .
- ^ Оги Дж.Н., Саутхолл, Т.Д. (январь 2016 г.). «Черт, это хорошо! DamID профилирование взаимодействий белок-ДНК» . Междисциплинарные обзоры Wiley: Биология развития . 5 (1): 25–37. дои : 10.1002/wdev.205 . ПМЦ 4737221 . ПМИД 26383089 .
- ^ Ши, Ян; Привет, Чуан; Аравинд, Л.; Сюй, Чи-Хун; Аристисабал-Корралс, Дэвид; Лю, Цзяньчжао; Сендинц, Эрдем; Гу, Лей; Уайт, Марио Эндрю (07 мая 2015 г.). «Метилирование ДНК N6-аденина у C. elegans» . Ячейка 161 (4): 868–878. дои : 10.1016/j.cell.2015.04.005 . ISSN 0092-8674 . ПМЦ 4427530 . ПМИД 25936839 .
- ^ Брукс Дж. Э., Робертс Р. Дж. (февраль 1982 г.). «Профили модификаций бактериальных геномов» . Исследования нуклеиновых кислот . 10 (3): 913–34. дои : 10.1093/нар/10.3.913 . ПМК 326211 . ПМИД 6278441 .
- ^ Сяо Р., Роман-Санчес Р., Мур Д.Д. (апрель 2010 г.). «DamIP: новый метод идентификации сайтов связывания ДНК in vivo» . Передача сигналов ядерных рецепторов . 8 : e003. дои : 10.1621/nrs.08003 . ПМЦ 2858267 . ПМИД 20419059 .
- ^ Перейти обратно: а б Саутхолл Т.Д., Голд К.С., Эггер Б., Дэвидсон К.М., Кейгилл Э.Э., Маршалл О.Дж., Брэнд А.Х. (июль 2013 г.). «Специфическое для типа клеток профилирование экспрессии генов и связывания хроматина без выделения клеток: анализ присутствия РНК Pol II в нервных стволовых клетках» . Развивающая клетка . 26 (1): 101–12. дои : 10.1016/j.devcel.2013.05.020 . ПМЦ 3714590 . ПМИД 23792147 .
- ^ Маршалл О.Дж., Саутхолл Т.Д., Читам С.В., Брэнд А.Х. (сентябрь 2016 г.). «Профилирование взаимодействий белок-ДНК с учетом типа клеток без выделения клеток с использованием целевого DamID и секвенирования нового поколения» . Протоколы природы . 11 (9): 1586–98. дои : 10.1038/нпрот.2016.084 . hdl : 10044/1/31094 . ПМК 7032955 . ПМИД 27490632 .
- ^ Тости Л., Эшмор Дж., Тан Б.С., Карбоне Б., Мистри Т.К., Уилсон В., Томлинсон С.Р., Каджи К. (апрель 2018 г.). «Картирование занятости фактора транскрипции с использованием минимального количества клеток in vitro и in vivo» . Геномные исследования . 28 (4): 592–605. дои : 10.1101/гр.227124.117 . ПМК 5880248 . ПМИД 29572359 .
- ^ Читам, Сет В.; Грюн, Вольфрам Х.; ван ден Амеле, Йелле; Крауц, Роберт; Саутхолл, Тони Д.; Кобаяши, Тошихиро; Сурани, М. Азим; Брэнд, Андреа Х. (05 сентября 2018 г.). «Целевой DamID обнаруживает дифференциальное связывание факторов плюрипотентности млекопитающих» . Разработка . 145 (20): дев.170209. дои : 10.1242/dev.170209 . ISSN 1477-9129 . ПМК 6215400 . ПМИД 30185410 .
- ^ Пиндюрин А.В., Пэджи Л., Кожевникова Е.Н., ван Аренсберген Дж., ван Стинсел Б. (июль 2016 г.). «Индуцируемые системы DamID для геномного картирования белков хроматина у дрозофилы» . Исследования нуклеиновых кислот . 44 (12): 5646–57. дои : 10.1093/нар/gkw176 . ПМЦ 4937306 . ПМИД 27001518 .
- ^ Хасс М.Р., Лиоу Х.Х., Чен Х, Шарма А., Иноуэ Ю., Иноуэ Т., Риб А., Мартенс А., Фулбрайт М., Раджу С., Стивенс М., Бойл С., Парк Дж.С., Вейраух М.Т., Брент М.Р., Копан Р. (август 2015 г.) ). «SpDamID: маркировка ДНК, связанной белковыми комплексами, идентифицирует усилители, чувствительные к Notch-димеру» . Молекулярная клетка . 59 (4): 685–97. doi : 10.1016/j.molcel.2015.07.008 . ПМЦ 4553207 . ПМИД 26257285 .
- ^ Уайнс ДР, Талберт П.Б., Кларк Д.В., Хеникофф С. (1996). «Введение ДНК-метилтрансферазы дрозофиле для исследования структуры хроматина in vivo». Хромосома . 104 (5): 332–40. дои : 10.1007/BF00337221 . PMID 8575244 . S2CID 22777948 .
- ^ Оги Дж.Н., Эстасио Гомес А., Томсон Дж., Инь Х., Саутхолл Т.Д. (февраль 2018 г.). «CATaDa обнаруживает глобальное ремоделирование доступности хроматина во время дифференцировки стволовых клеток in vivo» . электронная жизнь . 7 . doi : 10.7554/eLife.32341 . ПМК 5826290 . ПМИД 29481322 .
- ^ Cheetham SW, Brand AH (январь 2018 г.). «RNA-DamID обнаруживает специфическое для типа клеток связывание РНК roX в сайтах входа в хроматин» . Структурная и молекулярная биология природы . 25 (1): 109–114. дои : 10.1038/s41594-017-0006-4 . ПМК 5813796 . ПМИД 29323275 .
- ^ Клеар Ф., Мошкин Ю., Карч Ф., Маэда Р.К. (август 2006 г.). «Изучение регуляторных взаимодействий на расстоянии в комплексе Bithorax Drosophila melanogaster с использованием идентификации Dam». Природная генетика . 38 (8): 931–5. дои : 10.1038/ng1833 . ПМИД 16823379 . S2CID 22366940 .
- ^ Маршалл, Оуэн Дж.; Саутхолл, Тони Д.; Читам, Сет В.; Брэнд, Андреа Х. (сентябрь 2016 г.). «Профилирование взаимодействий белок-ДНК с учетом типа клеток без выделения клеток с использованием целевого DamID и секвенирования нового поколения» . Протоколы природы . 11 (9): 1586–1598. дои : 10.1038/нпрот.2016.084 . hdl : 10044/1/31094 . ISSN 1750-2799 . ПМК 7032955 . ПМИД 27490632 .
- ^ Добрый, Джоп; Пейги, Людо; де Врис, Сандра С.; Нахидиазар, Лейла; Дэй, Сиддхарт С.; Ну, Магда; Жан, Хэ; Ладжуа, Брайан; де Грааф, Кэролайн А. (24 сентября 2015 г.). «Полногеномные карты взаимодействий ядерных пластинок в отдельных клетках человека» . Ячейка 163 (1): 134–147. дои : 10.1016/j.cell.2015.08.040 . ISSN 1097-4172 . ПМЦ 4583798 . ПМИД 26365489 .
Дальнейшее чтение
[ редактировать ]- Фогель М.Дж., Перик-Хупкес Д., ван Стинсел Б. (2007). «Обнаружение in vivo взаимодействий белок-ДНК с использованием DamID в клетках млекопитающих» . Протоколы природы . 2 (6): 1467–78. дои : 10.1038/nprot.2007.148 . ПМК 7032955 . ПМИД 17545983 .
- Грейл Ф., Мурман С., ван Стинсел Б. (2006). «DamID: картирование белок-геномных взаимодействий in vivo с использованием привязанной ДНК-аденин-метилтрансферазы». ДНК-микрочипы, Часть A: Платформы для массивов и протоколы мокрых стендов . Методы энзимологии. Том. 410. стр. 342–59. дои : 10.1016/S0076-6879(06)10016-6 . ISBN 9780121828158 . ПМИД 16938559 .
- Германн С., Юул-Йенсен Т., Летарнец Б., Годен В. (октябрь 2006 г.). «DamID, новый инструмент для изучения профиля хроматина растений in vivo и его использования для идентификации предполагаемых целевых локусов LHP1» . Заводской журнал . 48 (1): 153–63. дои : 10.1111/j.1365-313X.2006.02859.x . ПМИД 16972870 .