Тегирование MS2
Мечение MS2 — это метод, основанный на естественном взаимодействии бактериофага MS2 белка оболочки со «стебель-петля» структурой генома фага . [ 1 ] который используется для биохимической очистки комплексов РНК-белок и в сочетании с GFP для обнаружения РНК в живых клетках. [ 2 ] Совсем недавно этот метод стал использоваться для мониторинга появления РНК в живых клетках, в месте транскрипции или просто путем наблюдения за изменениями количества РНК в цитоплазме. [ 3 ] [ 4 ] Это показало, что транскрипция как прокариотических, так и эукариотических генов происходит прерывисто, со всплесками транскрипции, разделенными нерегулярными интервалами.
Процедура
[ редактировать ]Начните с одноцепочечной РНК и создайте структуру структур «стебель-петля», добавляя копии РНК-связывающих последовательностей MS2 к некодирующей области. [ 5 ] Белок MS2 должен быть слит с GFP и связан с мРНК, комплексом, который содержит копии РНК-связывающей последовательности MS2. [ 5 ] Слитый белок MS2-GFP экспрессировали путем переноса его в клетку с помощью плазмиды [ 5 ] (лаборатория Роберта Сингера). Сигнал кодируется в РНК, и присутствие сигнала ядерной локализации (NLS) в GFP-MS2 представляет собой два сигнала, которые вводятся из комплексов EGFP-MS2-РНК. [ 6 ]
Аффинная очистка РНК, меченной биотином MS2 (MS2-BioTRAP), является одним из методов in vivo идентификации взаимодействий белок-РНК. [ 7 ] Экспрессировались как РНК, помеченная MS2, так и белковая метка MS2, а затем аффинное взаимодействие использовалось для облегчения процесса идентификации взаимодействий белок-РНК. [ 7 ]
Преимущества и недостатки
[ редактировать ]Преимущества:
Метод MS2-BioTRAP быстр, гибок и прост в настройке; он хорошо масштабируется и позволяет изучать физиологические условия взаимодействий белок-РНК. [ 7 ] Метка MS2 также эффективна для небольших молекул, когда белок оболочки MS2 используется для выделения различных рибонуклеопротеиновых частиц (РНП) . [ 8 ]
Недостатки:
Одним из недостатков мечения MS2 является то, что необходимо добавить множество копий стволовой петли MS2 внутрь РНК, чтобы произвести достаточный сигнал для просмотра и отслеживания одной молекулы РНК в ядре. [ 5 ] При отслеживании более чем одной последовательности РНК в ядре культивируемых клеток необходимо более одной целевой последовательности. [ 5 ] На это может влиять белок MS2, который имеет классический базовый сигнал ядерной локализации (NLS), поэтому он может влиять на расположение комплекса РНК, и ядро будет иметь большую часть GFP-MS2. [ 5 ] (лаборатория Роберта Сингера). [ 6 ] Накопление GFP-MS2 в ядре приведет к сильным сигналам ядерной флуоресценции, что задержит или предотвратит анализ ядерной локализации РНК, поскольку это будет препятствовать анализу сплайсинга, редактирования РНК, ядерного экспорта РНК и трансляции РНК. [ 6 ] Более того, из-за добавления метки во вторичную структуру РНК может вноситься артефакт. [ 5 ]
Кроме того, метка MS2 будет влиять на уровни экспрессии и регуляторные свойства малых некодирующих РНК (мРНК). [ 8 ] Кроме того, используя MS2 в качестве аффинной метки для очистки белка в бактериях E. coli , ученые экспрессировали MS2-MBP, который представляет собой белок оболочки MS2, несущий мутации, слитые с белками, связывающими мальтозу . Мутации предотвратили олигомеризацию . [ 8 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Йоханссон Х.Э., Лильяс Л., Уленбек О.К. (1997). «Распознавание РНК белком оболочки фага MS2». Семинары по вирусологии . 8 (3): 176–185. дои : 10.1006/smvy.1997.0120 .
- ^ Бертран Э., Чартран П., Шефер М., Шеной С.М., Сингер Р.Х., Лонг Р.М. (октябрь 1998 г.). «Локализация частиц мРНК ASH1 в живых дрожжах» . Молекулярная клетка . 2 (4): 437–45. дои : 10.1016/s1097-2765(00)80143-4 . ПМИД 9809065 .
- ^ Голдинг И., Паулссон Дж., Завильски С.М., Кокс EC (декабрь 2005 г.). «Кинетика активности генов отдельных бактерий в реальном времени» . Клетка . 123 (6): 1025–36. дои : 10.1016/j.cell.2005.09.031 . ПМИД 16360033 . S2CID 10319035 .
- ^ Чабб-младший, Трчек Т., Шеной С.М., Сингер Р.Х. (май 2006 г.). «Транскрипционная пульсация гена развития» . Современная биология . 16 (10): 1018–25. дои : 10.1016/j.cub.2006.03.092 . ПМЦ 4764056 . ПМИД 16713960 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж г «Живой и в цвете | Журнал Scientist Magazine®» . Ученый . Проверено 12 марта 2017 г.
- ^ Jump up to: а б с «Технология» . Люцерна, Инк . Проверено 12 марта 2017 г.
- ^ Jump up to: а б с Марчезе Д., де Гроот Н.С., Лоренцо Готор Н., Ливи К.М., Тарталья Г.Г. (ноябрь 2016 г.). «Достижения в характеристике РНК-связывающих белков» . Междисциплинарные обзоры Wiley: РНК . 7 (6): 793–810. дои : 10.1002/wrna.1378 . ПМК 5113702 . ПМИД 27503141 .
- ^ Jump up to: а б с Саид Н., Ридер Р., Гурвиц Р., Декерт Дж., Урлауб Х., Фогель Дж. (ноябрь 2009 г.). «Экспрессия и очистка малых регуляторов РНК, меченных аптамерами, in vivo» . Исследования нуклеиновых кислот . 37 (20): е133. дои : 10.1093/nar/gkp719 . ПМЦ 2777422 . ПМИД 19726584 .