Мальтозосвязывающий белок
| Периплазматический белок, связывающий мальтозу/мальтодекстрин | |||
|---|---|---|---|
 Мальтозосвязывающий белок из Escherichia coli со связанной молекулой сахара, показанной в виде красных сфер, из PDB : 1FQC . [ 1 ] | |||
| Идентификаторы | |||
| Организм | |||
| Символ | Мужской | ||
| ЮниПрот | P0AEX9 | ||
| |||
Мальтозосвязывающий белок ( MBP ) является частью мальтоза / мальтодекстрин системы Escherichia coli , которая отвечает за поглощение и эффективный катаболизм мальтодекстринов. Это сложная регуляторная и транспортная система, включающая множество белков и белковых комплексов. MBP имеет приблизительную молекулярную массу 42,5 килодальтон .
Структура и складывание
[ редактировать ]MBP кодируется MaleE геном Escherichia coli . Ген malE кодирует полипептид-предшественник (396 аминокислотных остатков), который дает зрелый MBP (370 остатков) при расщеплении NH 2 -концевого удлинения (26 остатков). Предшественник и зрелые формы ОБМ не содержат остатков цистеина . [ 2 ]
MBP представляет собой мономерный белок. Кристаллические структуры показали, что MBP разделен на два отдельных глобулярных домена , соединенных тремя короткими полипептидными сегментами. Два домена разделены глубокой бороздкой, в которой находится сайт связывания мальтозы/мальтодекстрина. Сравнение структур лигандированной и нелигандированной форм MBP показало, что связывание мальтозы вызывает серьезное конформационное изменение , которое закрывает бороздку за счет жесткого движения двух доменов вокруг связывающего полипептидного шарнира. [ 3 ] [ 4 ]
Как предшественники, так и зрелые формы MBP функциональны для связывания мальтозы. [ 5 ] Удлинение NH2 - конца снижает скорость сворачивания формы-предшественника ОБМ относительно его зрелой формы по меньшей мере в 5 раз, но не влияет на скорость разворачивания. [ 6 ] [ 7 ] Равновесное разворачивание ОБМ можно смоделировать двухуровневым механизмом со стабильностью ∆G(H 2 O), равной 9,45 ккал моль. −1 при 25 °C, pH 7,6. [ 8 ]
Локализация и экспорт
[ редактировать ]MBP экспортируется в периплазматическое пространство E. coli . [ 9 ] NH2 - концевое удлинение MBP, также называемое сигнальным пептидом , выполняет две роли: (i) оно замедляет сворачивание вновь синтезированного полипептида и (ii) направляет этот полипептид к мембране и транслокону SecYEG . После сворачивания предшественник больше не может вступать в путь транслокации. [ 10 ] Введение заряженного аминокислотного остатка или остатка пролина в гидрофобное ядро сигнального пептида достаточно для блокирования экспорта. [ 11 ] Дефектный экспорт мутантных MBP согласуется с альфа-спиральной конформацией и гидрофобными взаимодействиями сигнального пептида при его взаимодействии с транслокон-моторным белком SecA . [ 12 ] [ 13 ] [ 14 ]
Контроль выражения
[ редактировать ]Ген malE , кодирующий MBP, принадлежит к Mal-регулону E. coli , который состоит из десяти генов, продукты которых предназначены для эффективного поглощения и использования мальтозы и мальтодекстринов . Все гены, участвующие в транспорте мальтозы/мальтодекстрина, включая malE , сгруппированы в malB регионе E. coli и организованы в два расходящихся оперона : malE-malF-malG и malK-lamB . [ 15 ] Сайты начала транскрипции на MalaEp и MalKp промоторах расположены на расстоянии 271 пары оснований. [ 16 ]
Промоторы malEp и malKp синергически активируются белком MalT, активатором Mal-регулона, и белком CRP рецептора цАМФ . Эта активация представляет собой совмещенный процесс, который включает в себя переход от malEp к malKp : два сайта связывания MalT; три сайта связывания CRP и два перекрывающихся набора из трех сайтов связывания MalT, расположенных в шахматном порядке на три пары оснований. [ 16 ] [ 17 ] [ 18 ] Активация транскрипции требует связывания аденозинтрифосфата (АТФ) и мальтотриозы с MalT и связывания циклического АМФ с димером CRP. [ 19 ] Нелигандная форма MalT является мономерной, тогда как ее лигандная форма в присутствии АТФ и мальтотриозы является олигомерной. [ 20 ]
Использование в качестве белкового и пептидного вектора.
[ редактировать ]MBP используется для увеличения растворимости рекомбинантных белков, экспрессируемых в E. coli . В этих системах интересующий белок часто экспрессируется как слитый белок MBP , предотвращая агрегацию интересующего белка. Механизм, с помощью которого ОБМ увеличивает растворимость, недостаточно изучен. Кроме того, MBP сам по себе может использоваться в качестве аффинной метки для очистки рекомбинантных белков. Гибридный белок связывается со амилозы столбцами , в то время как все остальные белки проходят через него. Слитый белок MBP-белок можно очистить, элюируя колонку мальтозой. После получения слитого белка в очищенной форме интересующий белок часто отщепляется от ОБМ с помощью специфической протеазы и затем может быть отделен от ОБМ с помощью аффинной хроматографии .
Первое исследование связи между структурой и функциями ОБМ было проведено путем случайной вставки короткого фрагмента ДНК, кодирующего BamHI сайт рестрикции , в ген malE . Некоторые из вставок влияли на функции ОБМ, тогда как другие были разрешающими. [ 21 ] [ 22 ] Пермиссивные сайты, которые были внутренними по отношению к MBP, использовались для встраивания антигенных пептидов и воздействия на иммунный ответ у мышей. [ 23 ] Концевые вставки 3'-ОН были использованы для создания слитых белков и разработки использования MBP в качестве аффинного маркера для очистки чужеродных белков и пептидов с помощью аффинной хроматографии на поперечно-сшитой амилозе и элюирования мальтозой в мягких физико-химических условиях. [ 24 ] [ 25 ] Было разработано несколько плазмидных векторов для облегчения экспрессии и очистки таких слитых белков. [ 26 ]
Когда рекомбинантный MBP включает сигнальный пептид , слитый белок может экспортироваться в периплазматическое пространство , что облегчает его очистку, поскольку периплазматическая жидкость содержит лишь ограниченное количество белков и может быть восстановлена либо путем осмотического шока , либо путем пермеабилизации бактериальной среды. внешнюю мембрану антибиотиками , такими как полимиксин B. Такой экспорт слитого белка в периплазматическое пространство обеспечивает образование дисульфидных связей в белке-пассажире, например во фрагментах антител . [ 27 ] [ 28 ] Чужеродные белки, которые экспортируются или секретируются в нативном организме, обычно могут быть экспортированы в периплазму E. coli путем слияния с ОБМ. Примеры цитоплазматических белков, которые можно экспортировать путем слияния с MBP, включают мономерную полимеразу Кленова и димерный белок гена V фага М13 . [ 24 ] [ 29 ] Когда рекомбинантный MBP включает дефектный сигнальный пептид или не содержит сигнального пептида, слитый белок остается в бактериальной цитоплазме , откуда его можно извлечь путем вскрытия клеток .
Слияние белков с ОБМ обычно повышает их растворимость и облегчает их правильное сворачивание, поэтому слитые белки чаще всего являются бифункциональными. [ 24 ] [ 30 ] Кроме того, такие слияния могут облегчить кристаллизацию сложных белков, например мембранных белков. Структуру кристаллизованного белка часто можно решить с помощью рентгеновской кристаллографии с использованием молекулярной замены в известной структуре MBP. [ 31 ]
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Дуань, Сяоцюнь; Холл, Джейсон А; Никайдо, Хироши; Киочо, Флоранте А (март 2001 г.). «Кристаллические структуры мальтодекстрин/мальтозосвязывающего белка в комплексе с восстановленными олигосахаридами: гибкость третичной структуры и связывание лиганда». Журнал молекулярной биологии . 306 (5): 1115–1126. дои : 10.1006/jmbi.2001.4456 . ПМИД 11237621 .
- ^ Дюпле П., Бедуэль Х., Фаулер А., Забин И., Саурин В., Хофнунг М. (август 1984 г.). «Последовательности гена malE и его продукта, мальтозосвязывающего белка Escherichia coli K12» . Журнал биологической химии . 259 (16): 10606–13. дои : 10.1016/S0021-9258(18)91005-7 . ПМИД 6088507 .
- ^ Спурлино Дж.К., Лу Г.И., Киочо Ф.А. (март 1991 г.). «Структура разрешения 2,3-А мальтозо- или мальтодекстрин-связывающего белка, первичного рецептора бактериального активного транспорта и хемотаксиса». Журнал биологической химии . 266 (8): 5202–19. дои : 10.2210/pdb1mbp/pdb . ПМИД 2002054 .
- ^ Шарфф А.Дж., Родсет Л.Е., Спурлино Дж.К., Киочо Ф.А. (ноябрь 1992 г.). «Кристаллографические свидетельства большого, индуцированного лигандом шарнирно-поворотного движения между двумя доменами мальтодекстрин-связывающего белка, участвующего в активном транспорте и хемотаксисе». Биохимия . 31 (44): 10657–63. дои : 10.1021/bi00159a003 . ПМИД 1420181 .
- ^ Ференци Т., Рэндалл Л.Л. (октябрь 1979 г.). «Предшественник мальтозосвязывающего белка активен в связывании субстрата» . Журнал биологической химии . 254 (20): 9979–81. дои : 10.1016/S0021-9258(19)86659-0 . ПМИД 385604 .
- ^ Парк С., Лю Г., Топпинг ТБ, Кавер В.Х., Рэндалл Л.Л. (февраль 1988 г.). «Модуляция путей сворачивания экспортируемых белков с помощью лидерной последовательности». Наука . 239 (4843): 1033–5. Бибкод : 1988Sci...239.1033P . дои : 10.1126/science.3278378 . ПМИД 3278378 .
- ^ Бина К., Удгаонкар Дж.Б., Варадараджан Р. (март 2004 г.). «Влияние сигнального пептида на стабильность и кинетику сворачивания мальтозосвязывающего белка». Биохимия . 43 (12): 3608–19. дои : 10.1021/bi0360509 . ПМИД 15035631 .
- ^ Чун С.Ю., Стробель С., Бэссфорд П., Рэндалл Л.Л. (октябрь 1993 г.). «Сворачивание мальтозосвязывающего белка. Доказательства идентичности определяющего скорость этапа in vivo и in vitro» . Журнал биологической химии . 268 (28): 20855–62. дои : 10.1016/S0021-9258(19)36864-4 . ПМИД 8407916 .
- ^ Келлерманн О, Шмельцман С (август 1974 г.). «Активный транспорт мальтозы в Escherichia coli K12. Участие «периплазматического» мальтозосвязывающего белка» . Европейский журнал биохимии . 47 (1): 139–49. дои : 10.1111/j.1432-1033.1974.tb03677.x . ПМИД 4215651 .
- ^ Рэндалл Л.Л., Харди С.Дж. (сентябрь 1986 г.). «Корреляция способности к экспорту с отсутствием третичной структуры зрелых видов: исследование in vivo мальтозосвязывающего белка в E. coli». Клетка . 46 (6): 921–8. дои : 10.1016/0092-8674(86)90074-7 . ПМИД 3530497 . S2CID 28503725 .
- ^ Бедуэль Х., Бассфорд П.Дж., Фаулер А.В., Забин И., Беквит Дж., Хофнунг М. (май 1980 г.). «Мутации, которые изменяют функцию сигнальной последовательности мальтозосвязывающего белка Escherichia coli». Природа . 285 (5760): 78–81. Бибкод : 1980Natur.285...78B . дои : 10.1038/285078a0 . ПМИД 6990274 . S2CID 4253747 .
- ^ Бедуэль Х., Хофнунг М. (1981). «Функциональное значение анализа вторичной структуры сигнальных пептидов бактерий дикого типа и мутантных». Прогресс клинических и биологических исследований . 63 : 399–403. ПМИД 7312870 .
- ^ Чоу Ю.Т., Гираш Л.М. (сентябрь 2005 г.). «Конформация сигнального пептида, связанного с препротеиновой транслоказой SecA Escherichia coli» . Журнал биологической химии . 280 (38): 32753–60. дои : 10.1074/jbc.M507532200 . ПМИД 16046390 .
- ^ Гелис И, Бонвин А.М., Керамисану Д., Кукаки М., Гуридис Г., Караману С., Эконому А., Калодимос К.Г. (ноябрь 2007 г.). «Структурная основа распознавания сигнальной последовательности транслоказным мотором SecA, определенная с помощью ЯМР» . Клетка . 131 (4): 756–69. дои : 10.1016/j.cell.2007.09.039 . ПМК 2170882 . ПМИД 18022369 .
- ^ Боос В., Шуман Х. (март 1998 г.). «Мальтозно-мальтодекстриновая система Escherichia coli: транспорт, метаболизм и регуляция» . Обзоры микробиологии и молекулярной биологии . 62 (1): 204–29. дои : 10.1128/MMBR.62.1.204-229.1998 . ПМК 98911 . ПМИД 9529892 .
- ^ Jump up to: а б Бедуэль Х., Шмайснер У., Хофнунг М., Розенберг М. (ноябрь 1982 г.). «Промоторы оперонов malEFG и malK-lamB в Escherichia coli K12». Журнал молекулярной биологии . 161 (4): 519–31. дои : 10.1016/0022-2836(82)90405-3 . ПМИД 6185687 .
- ^ Бедуэль Х. (ноябрь 1983 г.). «Мутации в промоторных областях оперонов malEFG и malK-lamB Escherichia coli K12». Журнал молекулярной биологии . 170 (4): 861–82. дои : 10.1016/s0022-2836(83)80192-2 . ПМИД 6417341 .
- ^ Рише Э. (октябрь 2000 г.). «Синергетическая активация транскрипции: двойная роль СРБ в активации промотора Escherichia coli в зависимости от MalT и СРБ» . Журнал ЭМБО . 19 (19): 5222–32. дои : 10.1093/emboj/19.19.5222 . ПМК 302108 . ПМИД 11013224 .
- ^ Рише Э., Райбо О. (март 1989 г.). «MalT, регуляторный белок мальтозной системы Escherichia coli, является АТФ-зависимым активатором транскрипции» . Журнал ЭМБО . 8 (3): 981–7. дои : 10.1002/j.1460-2075.1989.tb03461.x . ПМК 400900 . ПМИД 2524384 .
- ^ Шрайбер В., Рише Э. (ноябрь 1999 г.). «Самоассоциация активатора транскрипции MalT Escherichia coli в присутствии мальтотриозы и АТФ» . Журнал биологической химии . 274 (47): 33220–6. дои : 10.1074/jbc.274.47.33220 . ПМИД 10559195 .
- ^ Дюпле П., Бедуэль Х., Шмельцман С., Хофнунг М. (1985). «Линкерный мутагенез в гене, кодирующем периплазматический мальтозосвязывающий белок E. coli». Биохимия . 67 (7–8): 849–51. дои : 10.1016/s0300-9084(85)80178-4 . ПМИД 3002495 .
- ^ Дюпле П., Шмельцман С., Бедуэль Х., Хофнунг М. (апрель 1987 г.). «Тихие и функциональные изменения в периплазматическом мальтозосвязывающем белке Escherichia coli K12. I. Транспорт мальтозы». Журнал молекулярной биологии . 194 (4): 663–73. дои : 10.1016/0022-2836(87)90243-9 . ПМИД 2821264 .
- ^ Коэфье Э, Клеман ЖМ, Кюссак В, Ходаи-Буран Н, Жеанно М, Рохас М, Дриди А, Латур М, Эль Хабиб Р, Барре-Синусси Ф, Хофнунг М, Леклерк С (ноябрь 2000 г.). «Антигенность и иммуногенность эпитопа gp41 ВИЧ-1 ELDKWA, встроенного в пермиссивные сайты белка MalE». Вакцина . 19 (7–8): 684–93. дои : 10.1016/s0264-410x(00)00267-x . ПМИД 11115689 .
- ^ Jump up to: а б с Бедуэль Х., Дюплей П. (февраль 1988 г.). «Производство в Escherichia coli и одностадийная очистка бифункциональных гибридных белков, связывающих мальтозу. Экспорт полимеразы Кленова в периплазматическое пространство» . Европейский журнал биохимии . 171 (3): 541–9. дои : 10.1111/j.1432-1033.1988.tb13823.x . ПМИД 3278900 .
- ^ Рондар П., Брежер Ф., Лекруаз А., Делепьер М., Бедуэль Х. (июль 1997 г.). «Конформационные и функциональные свойства ундекапептидного эпитопа, слитого с С-концом мальтозосвязывающего белка». Биохимия . 36 (29): 8954–61. CiteSeerX 10.1.1.599.2650 . дои : 10.1021/bi962508d . ПМИД 9220983 .
- ^ Ди Гуань С., Ли П., Риггс П.Д., Иноуе Х. (июль 1988 г.). «Векторы, которые облегчают экспрессию и очистку чужеродных пептидов в Escherichia coli путем слияния с мальтозосвязывающим белком». Джин . 67 (1): 21–30. дои : 10.1016/0378-1119(88)90004-2 . ПМИД 2843437 .
- ^ Брежер Ф., Шварц Дж., Бедуэль Х. (февраль 1994 г.). «Бифункциональные гибриды вариабельных доменов иммуноглобулина и мальтозосвязывающего белка Escherichia coli: производство, очистка и связывание антигена». Белковая инженерия . 7 (2): 271–80. ПМИД 8170930 .
- ^ Малик А. (июнь 2016 г.). «Теги слияния белков для эффективной экспрессии и очистки рекомбинантных белков в периплазматическом пространстве E. coli» . 3 Биотехнологии . 6 (1): 44. дои : 10.1007/s13205-016-0397-7 . ПМЦ 4742420 . ПМИД 28330113 .
- ^ Блондель А., Бедуэль Х. (октябрь 1990 г.). «Экспорт и очистка цитоплазматического димерного белка путем слияния с мальтозосвязывающим белком Escherichia coli» . Европейский журнал биохимии . 193 (2): 325–30. дои : 10.1111/j.1432-1033.1990.tb19341.x . ПМИД 2226455 .
- ^ Капуст Р.Б., Во Д.С. (август 1999 г.). «Мальтозосвязывающий белок Escherichia coli необычайно эффективен в повышении растворимости полипептидов, с которыми он слит» . Белковая наука . 8 (8): 1668–74. дои : 10.1110/ps.8.8.1668 . ПМК 2144417 . ПМИД 10452611 .
- ^ Во Д.С. (март 2016 г.). «Кристаллические структуры слитых белков MBP» . Белковая наука . 25 (3): 559–71. дои : 10.1002/pro.2863 . ПМЦ 4815407 . ПМИД 26682969 .
Внешние ссылки
[ редактировать ]- N-концевое слияние целевого белка с мальтозосвязывающим белком в Мичиганском технологическом университете
- мальтоза-связывание + белок Национальной медицинской библиотеки США по медицинским предметным рубрикам (MeSH)
- Общий протокол экспрессии и очистки рекомбинантных белков в Escherichia coli с использованием комбинаторной гибридной метки белка, связывающего His6-мальтозу.