ЭЛИСпот
 |
Пятно иммуноферментного иммуносорбента ( ELISpot ) — это тип анализа , который фокусируется на количественном измерении частоты секреции цитокинов для одной клетки. Анализ ELISpot также является формой иммуноокрашивания , поскольку он классифицируется как метод, в котором используются антитела для обнаружения белкового аналита, при этом слово аналит относится к любому биологическому или химическому веществу, которое идентифицируется или измеряется.
Анализ FluoroSpot представляет собой вариант анализа ELISpot. Анализ FluoroSpot использует флуоресценцию для анализа нескольких аналитов, что означает, что он может обнаружить секрецию более чем одного типа белка.
История
[ редактировать ]Сесил Черкинский впервые описал ELISpot в 1983 году как новый способ количественного определения продукции антиген-специфического иммуноглобулина гибридомными клетками .В 1988 году Черкинский разработал точечный анализ ELISA , позволяющий количественно оценить секрецию лимфокина Т клетками - .В том же году двухцветный ELISpot впервые был совмещен с компьютерной визуализацией, что позволило подсчитывать и анализировать пятна.1988 год также ознаменовал первое использование планшетов с мембранным дном для проведения этих анализов. [1]
Механизм ELISpot
[ редактировать ]- Покрытие антителами : при использовании метода ELISpot Assay в лунки добавляются и вымываются из лунок различные вещества. Лунки находятся на лабораторной пластине с крошечными чашками/чашами, которые можно заполнить исследуемым веществом; количество лунок на планшете варьируется, но обычно колеблется в пределах 16-100. Первым веществом, добавляемым в лунки, являются цитокин-специфические моноклональные антитела. Эти антитела покрывают стенки лунок для будущего связывания с цитокином. Моноклональные антитела означают, что антитела производятся из одной клеточной линии и способны связываться только с одним белковым эпитопом . С другой стороны, поликлональные антитела способны связываться с несколькими эпитопами одного и того же белка.
- Инкубация клеток . В лунки добавляются желаемые клетки, подлежащие наблюдению и анализу. Каждая лунка может иметь наличие или отсутствие стимулов, активирующих секрецию цитокинов в клетках. Во время инкубации клеток клетки могут реагировать на любые присутствующие стимулы и секретировать цитокины. Существует множество процедур и методов, которым необходимо следовать, чтобы обеспечить правильную обработку клеток. Чтобы убедиться в высоком качестве клеток, клетки в образцах крови следует слегка встряхивать, если они хранятся более 3 часов, образцы крови следует разводить в PBS ( физраствор с фосфатным буфером ) перед хранением, а образцы крови не должны гранулоциты . Любым клеткам, которые были криоконсервированы и разморожены, следует дать постоять в течение часа или более при температуре 37 градусов по Цельсию (типичная температура человеческого тела). [2] Есть также много вещей, которые следует учитывать при инкубации клеток, например, следить за тем, чтобы клетки не подвергались резким движениям, которые могли бы повлиять на образование пятен, или чтобы влажность в инкубаторе была достаточно высокой, чтобы избежать чрезмерного испарения и высыхания клеток. колодцы. [3]
- Захват цитокинов : поскольку клетки окружены цитокин-специфичными моноклональными антителами, которые покрывают стенки лунок, цитокин, секретируемый инкубированными клетками, начнет прикрепляться к антителам в определенном эпитопе.
- Обнаружение антител : на этом этапе лунки необходимо промыть, чтобы избавиться от клеток и любых других нежелательных веществ. Все, что должно остаться, — это моноклональные антитела, специфичные к цитокинам, и любые цитокины, которые связаны с антителами. биотинилированные Затем в лунку добавляют антитела, специфичные для обнаружения цитокинов. Эти цитокин-специфические антитела для обнаружения будут связываться с любым цитокином, оставшимся в лунке, поскольку цитокин все еще прикреплен к первому набору использованных антител. Поскольку цитокин прикреплялся к первому набору антител, покрывающих лунки, цитокин не вымывался при промывании лунок.
- Конъюгат стрептавидин-фермент : Конъюгат стрептавидин-фермент добавляют в лунки для связывания с детектирующими антителами. Целью биотинилирования антител для обнаружения цитокинов, добавленных в лунки на предыдущем этапе, является обеспечение возможности связывания антител с новым конъюгатом стрептавидин-фермент. Биотинилирование в основном создает сильное сродство между биотином цитокин-специфического антитела и стрептавидином конъюгата. [4]
- Добавление субстрата . В лунки добавляется субстрат, который катализируется конъюгатом фермента, добавленным на предыдущем этапе. В результате этой реакции образуется нерастворимый осадок, образующий пятна в лунках. Субстрат, который вы используете на этом этапе, будет зависеть от типа фермента, использованного на предыдущем этапе. Если используется стрептавидин-АЛФ (конъюгат стрептавидина и щелочной фосфатазы), то с использованием BCIP/NBT-plus (смесь 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата и нитросинего тетразолия хлорида) [5] в качестве подложки будут образовываться более четкие пятна, которые легче анализировать. Если используется стрептавидин-HRP (конъюгат стрептавидина и пероксидазы хрена), то с использованием ТМБ (тетраметилбензидина) [6] в качестве субстрата даст лучшие результаты. [7]
- Анализ : Образовавшиеся пятна затем можно прочитать на автоматическом считывателе ELISpot или подсчитать под диссекционным микроскопом и в дальнейшем использовать для расчета частоты секреции цитокинов.
Механизм FluoroSpot
[ редактировать ]Анализ FluoroSpot очень похож на анализ ELISpot. Основное отличие состоит в том, что анализ FluoroSpot позволяет анализировать наличие нескольких аналитов в одном планшете с лунками, тогда как анализ ELISpot может анализировать только один аналит за раз. Анализ FluoroSpot позволяет достичь этого, используя для обнаружения флуоресценцию, а не ферментативную реакцию. Шаги анализа FluoroSpot также аналогичны, с некоторыми отличиями. [8]
- Покрытие антителами : Как и в случае с ELISpot, в планшет с лунками добавляются моноклональные захватывающие антитела, специфичные для цитокинов. Для обоих анализов планшеты обрабатываются этанолом, чтобы избежать загрязнения и искажения сбора данных. Для анализа FluoroSpot к лункам прикрепляют смесь различных типов захватывающих антител для обнаружения нескольких типов аналитов. Чтобы получить оптимальные результаты при использовании анализов ELISpot и FluoroSpot, следует соблюдать правильные методы нанесения покрытия на планшеты. Планшеты следует обработать этанолом, промыть, а затем покрыть антителами. Методы обработки этанолом также различаются в зависимости от типа используемых пластин. Для планшетов MSIP и IPFL во все лунки следует добавить по 15 микролитров 35% этанола. Оставьте этанол в лунках на одну минуту, а затем вылейте его. Для планшетов MAIPSWU вместо этого во все лунки следует добавить по 50 микролитров 70% этанола. Оставьте этанол в лунках на две минуты, а затем вылейте его. После обработки лунок этанолом необходимо промыть все лунки 200 микролитрами стерильной воды. Этот процесс промывания следует повторить в общей сложности 5 раз. После обработки лунок этанолом и промывки в каждую лунку можно добавить моноклональные захватывающие антитела, специфичные для цитокинов. [9]
- Инкубация клеток . Клетки добавляют в лунки и инкубируют в присутствии или в отсутствие стимулов, влияющих на секрецию белка.
- Захват цитокинов : Белки/аналиты, секретируемые инкубируемыми клетками, связываются с захватывающими антителами, прикрепленными к лункам на первом этапе.
- Антитела для обнаружения : как и в случае с ELISpot, после промывки лунок, чтобы избавиться от клеток и других веществ, в идентификации или измерении которых мы не заинтересованы, добавляется биотинилированное антитело для обнаружения (оно специфично для одного типа аналита, который вы хотите для количественного определения), а затем добавляют меченые меткой детектирующие антитела для второго и третьего типов исследуемых аналитов.
- Конъюгаты, меченные флуорофором . Вместо добавления конъюгата стрептавидин-фермент обнаружение нескольких аналитов усиливается в FluoroSpot с использованием меченных флуорофором анти-меточных антител и конъюгата стрептавидин-флуорофор. На этом этапе также добавляется раствор усилителя флуоресценции , чтобы улучшить сигналы, которые позже будут использоваться при анализе цветов флуоресценции в лунках. Именно эта флуоресценция позволяет FluoroSpot анализировать и сравнивать несколько аналитов, в отличие от ELISpot.
- Анализ : поскольку FluoroSpot основан на использовании флуоресценции, а не ферментативной реакции, нет необходимости в добавлении субстрата для реакции с ферментами (как это необходимо для ELISpot). Последним этапом анализа FluoroSpot является анализ флуорофоров с помощью автоматического флуоресцентного считывателя, который имеет отдельные фильтры для различных анализируемых флуорофоров. Эти фильтры следует выбирать для конкретных длин волн флуорофоров, если вы хотите получить точные измерения. [8]
Поскольку анализ FluoroSpot идентифицирует и количественно определяет присутствие нескольких аналитов, возможно, что абсорбция одного аналита может повлиять на секрецию другого аналита; это называется эффектами захвата. [8] Влияние аналита на другой аналит может быть положительным или отрицательным (производство второго аналита может как увеличиваться, так и уменьшаться). Чтобы противодействовать эффектам захвата, можно использовать совместную стимуляцию, чтобы обойти снижение производства аналита. [8] Это когда в лунки добавляют второе антитело, которое стимулирует выработку того же аналита.
Применение ELISpot и FluoroSpot
[ редактировать ]Анализы ELISpot и FluoroSpot можно использовать во многих областях исследований: разработка вакцин, [10] рак, [11] аллергия, [12] характеристика моноцитов/макрофагов/дендритных клеток, анализ аполипопротеинов и ветеринарные исследования. С помощью ELISpot вы можете изучать реакцию антигенспецифических цитокинов, клетки, секретирующие антитела, [13] опухолевые антигены, [11] высвобождение гранзима B и перфорина Т-клетками, эффективность вакцины, [14] картирование эпитопов, [15] цитотоксическая активность Т-клеток, обнаружение IL-4, IL-5 и IL-13, [12] индуцированные вакциной реакции антител, антигенспецифические В-клетки памяти, [10] и многое другое.
Более конкретно, анализ ELISpot Т-клеток используется для характеристики подмножеств Т-клеток. Это связано с тем, что анализ может обнаружить выработку цитокинов IFN-y, IL-2, TNF-альфа, IL-4, IL-5 и IL-13. Первые три цитокина продуцируются клетками Th1, а последние три — клетками Th2. Измерение реакции Т-клеток посредством продукции цитокинов также позволяет изучить эффективность вакцины. [16]
С помощью T-cell FluoroSpot вы можете контролировать лимфоциты, проникающие в опухоль. Вы также можете проанализировать секрецию цитокина IFN-y и гранзима B, чтобы оценить цитотоксические реакции Т-клеток. Оба они используются для исследования рака. [17]
С помощью B-cell FluoroSpot эффективность вакцины также можно наблюдать путем количественного определения секреции IgG, IgA и IgM до и после вакцинации. Этот анализ нескольких иммуноглобулинов стал возможен благодаря методу флуоресценции, используемому в FluoroSpot. [17]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Раньери, Елена; Попеску, Юлия; Гиганте, Маргарита (2014). «Анализ CTL ELISPOT». Цитотоксические Т-клетки . Методы молекулярной биологии. Том. 1186. стр. 75–86. дои : 10.1007/978-1-4939-1158-5_6 . ISBN 978-1-4939-1157-8 . ПМИД 25149304 .
- ^ «Ячейки для ELISpot и FluoroSpot» . МАБТЕХ . Проверено 6 декабря 2018 г.
- ^ «Инкубация клеток» . МАБТЕХ . Проверено 6 декабря 2018 г.
- ^ «Биотинилирование» . ТермоФишер Сайентифик . Проверено 6 декабря 2018 г.
- ^ «Сводка паспортов безопасности BCIP/NBT-plus» (PDF) . МАБТЕХ . Проверено 6 декабря 2018 г.
- ^ «Техническое описание/протокол TMB» (PDF) . МАБТЕХ . Проверено 6 декабря 2018 г.
- ^ «Субстраты ELISpot» . МАБТЕХ . Проверено 6 декабря 2018 г.
- ^ Jump up to: а б с д «Принцип анализа FluoroSpot» . МАБТЕХ . Проверено 6 декабря 2018 г.
- ^ «Руководство по покрытию пластин» . МАБТЕХ . Проверено 6 декабря 2018 г.
- ^ Jump up to: а б «Разработка вакцины» . МАБТЕХ . Проверено 6 декабря 2018 г.
- ^ Jump up to: а б "Рак" . МАБТЕХ . Проверено 6 декабря 2018 г.
- ^ Jump up to: а б «Аллергия» . МАБТЕХ . Проверено 6 декабря 2018 г.
- ^ Черкинский, CC (16 декабря 1983 г.). «Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISPOT) для подсчета специфических клеток, секретирующих антитела». Журнал иммунологических методов . 65 (1–2): 109–121. дои : 10.1016/0022-1759(83)90308-3 . ПМИД 6361139 .
- ^ Салетти, Джульетта (9 мая 2013 г.). «Точечный иммуноферментный анализ для прямого измерения ex vivo гуморального иммунного ответа человека в крови, вызванного вакциной». Протоколы природы . 8 (6): 1073–1087. дои : 10.1038/нпрот.2013.058 . ПМИД 23660756 . S2CID 38317207 .
- ^ «Т-клеточные анализы ELISpot» . ПРОИММУН . Проверено 6 декабря 2018 г.
- ^ Стрэнд, Нака. «Найдите 1 клетку из 100 000 с помощью ELISpot» (PDF) . МАБТЕХ . Проверено 6 декабря 2018 г.
- ^ Jump up to: а б Стрэнд, Нака. «Узнайте больше с FluoroSpot» (PDF) . МАБТЕХ . Проверено 6 декабря 2018 г.