Гелевое пищеварение
Стадия гидролиза в геле является частью подготовки проб для масс-спектрометрической идентификации белков в ходе протеомного анализа . Метод был предложен в 1992 году Розенфельдом. [1] Остаются бесчисленные модификации и улучшения основных элементов процедуры. [2] [3] [4] [5] [6] [7]
Стадия гидролиза в геле в основном состоит из четырех стадий; обесцвечивание, восстановление и алкилирование (R&A) цистеинов в белке, протеолитическое расщепление белка и экстракция образующихся пептидов .
Окрашивание
[ редактировать ]Белки, которые были разделены с помощью 1D или 2D PAGE, обычно визуализируются путем окрашивания такими красителями , как кумасси бриллиантовый синий (CBB) или серебро . Хотя чувствительность метода значительно ниже, использование Кумасси более распространено для образцов, предназначенных для масс-спектрометрии, поскольку окрашивание серебром ухудшает анализ. После вырезания интересующей белковой полосы из геля большинство протоколов требуют обесцвечивания белков перед продолжением.
Окрашивающий раствор для CBB обычно содержит буферную соль бикарбоната аммония (NH 4 HCO 3 ) и фракцию 30-50% органического растворителя (чаще всего ацетонитрил ). Гидрофобные взаимодействия между белком и CBB уменьшаются за счет органической фракции раствора. [8] В то же время ионная часть раствора ослабляет электростатические связи между красителем и положительно заряженными аминокислотами белка. В отличие от смеси воды с органическим растворителем эффективность окрашивания повышается. Повышение температуры ускоряет процесс обесцвечивания. [9] В определенной степени (< 10%) процедура обесцвечивания сопровождается потерей белка. [10] Кроме того, удаление CBB не влияет на выход пептидов при масс-спектрометрическом измерении. [7] [11]
В случае белковых полос, окрашенных серебром, обесцвечивание достигается окислением металлического прикрепленного серебра, к белку, феррицианидом калия или перекисью водорода (H 2 O 2 ). [12] [13] Высвободившиеся ионы серебра впоследствии образуют комплекс с тиосульфатом натрия .
Восстановление и алкилирование (R&A)
[ редактировать ]Окрашивание и обесцвечивание гелей часто сопровождается восстановлением и алкилированием (r&a) цистинов или цистеинов в белках. При этом дисульфидные связи белков необратимо разрываются и оптимальное разворачивание третичной структуры достигается . Восстановление до тиола осуществляется реакцией с химическими веществами, содержащими сульфгидрильные или фосфиновые группы, такими как дитиотреитол (DTT) или гидрохлорид трис-2-карбоксиэтилфосфина (TCEP). В ходе последующего необратимого алкилирования SH-групп иодацетамидом цистеины превращаются в стабильный S-карбоксиамидометилцистеин (САМ; аддукт: -CH 2 -CONH 2 ). Таким образом, молекулярная масса аминокислотного остатка цистеина увеличивается со 103,01 Да до 160,03 Да.
Восстановление и алкилирование остатков цистеина улучшает выход пептидов и покрытие последовательностей, а также идентификацию белков с большим количеством дисульфидных связей. [14] [15] Из-за редкости аминокислоты цистеина для большинства белков стадия r&a не приводит к улучшению результатов масс-спектрометрического анализа. [5] [10] [16] [17] Для количественного и гомогенного алкилирования цистеинов решающее значение имеет положение стадии модификации в процессе подготовки проб. При денатурирующем электрофорезе настоятельно рекомендуется проводить реакцию до проведения электрофореза, поскольку акриламида, способные необратимо модифицировать остатки цистеина. имеются свободные мономеры в геле [18] [19] [20] [21] Образующиеся аддукты акриламида имеют молекулярную массу 174,05 Да .
Гелевое пищеварение
[ редактировать ]После этого выполняется одноименный этап метода - расщепление белков в геле. С помощью этой процедуры белок ферментативно разрезается на ограниченное количество более коротких фрагментов. Эти фрагменты называются пептидами и позволяют идентифицировать белок по его характерной массе и рисунку. Сериновая протеаза трипсин является наиболее распространенным ферментом, используемым в анализе белков. Трипсин разрезает пептидную связь именно на карбоксильном конце основных аминокислот аргинина и лизина . Если в непосредственной близости от места разреза находится кислая аминокислота, такая как аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота , скорость гидролиза снижается, а пролин С-концевой в месте разреза полностью ингибирует гидролиз . [22]
Нежелательным побочным эффектом использования протеолитических ферментов является самопереваривание протеазы. Чтобы избежать этого, в прошлом Ca 2+ -ионы добавляли в буфер для расщепления. [23] [24] В настоящее время большинство поставщиков предлагают модифицированный трипсин, в котором селективное метилирование лизинов ограничивает автолитическую активность участками разрезания аргинина. [25] Немодифицированный трипсин имеет максимальную активность при температуре от 35 до 45 °C. После модификации оптимальная температура изменена на диапазон от 50°С до 55°С. [16] [26] Другими ферментами, используемыми для расщепления в геле, являются эндопротеазы Lys -C , [27] [28] [29] Глю-С , [30] [31] [32] Асп-Н [33] и Лис-Н . [34] [35] Эти протеазы специфично разрезают только одну аминокислоту, например Asp-N разрезает n-конец аспарагиновой кислоты. [27] Следовательно, получается меньшее количество более длинных пептидов.
Анализ полной первичной последовательности белка с использованием только одной протеазы обычно невозможен. В таких случаях рекомендуется расщепление целевого белка несколькими подходами с использованием разных ферментов. Полученные перекрывающиеся пептиды позволяют собрать полную последовательность белка. [30] [36] [37]
Для переваривания белки, зафиксированные в матрице геля, должны быть доступны для протеазы. Считается, что проникновению фермента в гель способствует обезвоживание кусочков геля при обработке ацетонитрилом и последующее набухание в буфере для расщепления, содержащем протеазу. Эта процедура основана на предположении, что протеаза проникает в гель в процессе набухания. [2] Различные исследования проникновения ферментов в гель показали, что этот процесс почти полностью обусловлен диффузией. Высыхание геля, похоже, не способствует этому процессу. [7] [16] Следовательно, улучшение расщепления в геле должно быть достигнуто за счет сокращения пути фермента к его субстрату, например, путем разрезания геля на кусочки как можно меньшего размера.
Обычно гелевое расщепление проводится в течение ночи. При использовании трипсина в качестве протеазы и температуре 37°С время инкубации, установленное в большинстве протоколов, составляет 12-15 часов. Однако эксперименты по продолжительности процесса пищеварения показали, что уже через 3 ч материала достаточно для успешного масс-спектрометрического анализа. [38] Кроме того, оптимизация условий для протеазы по температуре и pH позволяет завершить расщепление образца за 30 минут. [16]
Поверхностно-активные вещества (детергенты) могут способствовать солюбилизации и денатурации белков в геле и тем самым сокращать время переваривания и увеличивать расщепление белков, а также количество и количество экстрагируемых пептидов, особенно липофильных белков, таких как мембранные белки . Расщепляемые детергенты – это детергенты, которые расщепляются после расщепления, часто в кислых условиях. Это делает добавление моющих средств совместимым с масс-спектрометрией.
Добыча
[ редактировать ]После завершения расщепления пептиды, образующиеся в этом процессе, необходимо экстрагировать из матрицы геля. Это достигается за счет одного или нескольких этапов экстракции . Частицы геля инкубируют с экстракционным раствором и собирают надосадочную жидкость. При первой экстракции извлекается почти весь пептид, повторение этапа экстракции позволяет увеличить выход всего процесса всего на 5-10%. [10] Чтобы удовлетворить потребности в пептидах с различными физическими и химическими свойствами, проводят итерационную экстракцию основными или кислыми растворами. Для экстракции кислых пептидов используют раствор, аналогичный по концентрации и составу буферу для расщепления; основные пептиды экстрагируют в зависимости от предполагаемого масс-спектрометрического метода низкоконцентрированным кислым раствором муравьиной кислоты для ESI и трифторуксусной кислоты для MALDI соответственно. Исследования модельных белков показали восстановление примерно 70–80% ожидаемого выхода пептида при экстракции из геля. [10] Многие протоколы содержат дополнительную фракцию ацетонитрила в экстракционном растворе, который в концентрациях выше 30% (об./об.) эффективен для снижения адсорбции пептидов на поверхности реакционных пробирок и наконечников пипеток . [39] Жидкость объединенных экстрактов выпаривают в центробежном испарителе . Если летучий , бикарбонат аммония для основной экстракции использовался он частично удаляется в процессе сушки. Высушенные пептиды можно хранить при температуре -20 °C не менее шести месяцев.
Критические соображения и актуальные тенденции
[ редактировать ]Некоторыми основными недостатками распространенных протоколов расщепления в геле являются необходимое длительное время и несколько этапов обработки, что делает метод подверженным ошибкам в отношении загрязнений (особенно кератина ). Эти недостатки были в значительной степени устранены благодаря разработке оптимизированных протоколов и специализированных реакционных пробирок. [7]
Более серьезными, чем трудности с обращением, являются потери материала при обработке образцов. Масс-спектрометрический анализ белков часто проводится на пределе обнаружения, поэтому даже небольшие потери могут определять успех или неудачу всего анализа. Эти потери происходят из-за вымывания на различных этапах обработки, адсорбции на поверхности реакционных пробирок и наконечников пипеток , неполной экстракции пептидов из геля и/или плохой ионизации отдельных пептидов в масс-спектрометре . [10] [40] В зависимости от физико-химических свойств пептидов потери могут варьироваться от 15 до 50%. Из-за присущей пептидам гетерогенности до сих пор не найдено универсальное решение этого основного недостатка метода.
Коммерческие реализации
[ редактировать ]Коммерческое внедрение гелевого расщепления следует разделить на продукты для лабораторий с высокой и низкой производительностью.
Высокая пропускная способность
[ редактировать ]Из-за высокой трудоемкости и трудоемкости стандартной процедуры метод гелевого расщепления был ограничен относительно небольшим количеством белковых пятен, подлежащих обработке за один раз. Таким образом, было обнаружено, что он является идеальным объектом для реализации планов по автоматизации , позволяющих преодолеть эти ограничения для промышленных и сервисных лабораторий. [41] Сегодня в лабораториях, где гелевое расщепление проводится с высокой производительностью, процедура обычно автоматизирована. Степень автоматизации варьируется от простых роботов- пипетировщиков до сложных комплексных решений, предлагающих автоматизированный рабочий процесс от геля до масс-спектрометрии. Системы обычно состоят из сборщика пятен, робота для пищеварения и корректировщика.
Преимущества автоматизации, помимо большего количества обрабатываемых одновременно участков, заключаются в сокращении ручной работы и улучшенной стандартизации . Из-за большого количества этапов обработки, результаты ручного процесса могут варьироваться в зависимости от ловкости пользователя, а риск загрязнения высок. Таким образом, качество результатов считается одним из основных преимуществ автоматизированного процесса. [42]
Недостатками автоматизированных решений являются затраты на роботов, обслуживание и расходные материалы, а также сложная настройка процесса. Поскольку для автоматического сбора требуется оцифрованная информация о местоположении пятна, анализ изображения геля на наличие соответствующих пятен должен выполняться с помощью программного обеспечения, требующего стандартизированных методов визуализации и специальных сканеров. Эта длительная процедура не позволяет исследователю спонтанно идентифицировать несколько интересных пятен из одного геля, а также от необходимости использовать системы на полную мощность. Полученный объем данных в результате последующего автоматизированного МС-анализа является еще одной проблемой систем с высокой пропускной способностью, поскольку их качество часто сомнительно, а оценка этих данных занимает значительно больше времени, чем сбор. [43] [44]
Низкая пропускная способность
[ редактировать ]Указанные недостатки ограничивают целесообразность применения автоматизированных систем внутригельного расщепления рутинной лабораторией, тогда как исследовательская лаборатория с требованием гибкого использования инструментов идентификации белков чаще останавливается на ручных, малопроизводительных методах исследования. гель-расщепление и МС-анализ. На эту группу клиентов нацелена промышленность, предлагающая несколько систем комплектов для гелеобразного расщепления.
Большинство систем наборов представляют собой просто набор химикатов и ферментов, необходимых для расщепления в геле, тогда как основной протокол остается неизменным по сравнению со стандартной ручной процедурой, описанной выше. Преимущество этих продуктов для неопытного заказчика заключается в гарантированном функционировании разнообразных решений в сочетании с готовым протоколом процесса.
Несколько компаний попытались улучшить процесс гидролиза в геле, чтобы даже при ручной подготовке проб сделать рабочий процесс более простым и стандартизированным. Набор Montage In-Gel Digest Kit от Millipore основан на стандартном протоколе, но позволяет обрабатывать большое количество параллельных образцов путем переноса манипуляций с кусочками геля на модифицированный 96-луночный микропланшет. Растворы для различных стадий гелевого расщепления вносятся пипеткой в лунки этого планшета, тогда как удаление жидкостей осуществляется через дно лунок с помощью вакуумного насоса . Эта система упрощает выполнение нескольких этапов пипетирования за счет использования многоканальных пипеток и даже роботов для пипетирования. Фактически, некоторые производители высокопроизводительных систем внедрили эту систему для работы со своими роботами. Это иллюстрирует ориентацию данного набора на лаборатории с большим количеством образцов.
См. также
[ редактировать ]- Зимография , несвязанный с ней метод молекулярной биологии, который также включает расщепление белков в электрофоретическом геле.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Розенфельд Дж. и др., Anal Biochem , 1992, 203 (1), 173-9.
- ^ Перейти обратно: а б Хеллман У. и др., Anal Biochem , 1995, 224 (1), 451-455.
- ^ Джено, П. и др., Anal Biochem , 1995, 224 (1), 75-82.
- ^ Shevchenko, A et al., Anal Chem , 1996, 68 (5), 850-8.
- ^ Перейти обратно: а б Borchers, C et al., Anal Chem , 2000, 72 (6), 1163-8.
- ^ Шевченко А. и др., Nat Protoc , 2006, 1 (6), 2856-60.
- ^ Перейти обратно: а б с д Гранвогл Б. и др., Протеомика , 2007, 7 (5), 642-54.
- ^ Джин, Ю и Манабе, Т., Электрофорез , 2005, 26 (6), 1019-28.
- ^ Ллойд, доктор медицинских наук, Anal Biochem , 1996, 241 (1), 139-40.
- ^ Перейти обратно: а б с д и Спейчер, К.Д. и др., Журнал биомолекулярных технологий , 2000, 11 (2), 74-86.
- ^ Терри, Д.Э. и др., J Am Soc Mass Spectrom , 2004, 15 (6), 784-94.
- ^ Гарахдаги, Ф. и др., Электрофорез , 1999, 20 (3), 601-5.
- ^ Самнер, Л.В. и др., Масс-спектр Rapid Commun , 2002, 16 (3), 160-8.
- ^ Хейл, Дж. Э. и др., Anal Biochem , 2004, 333(1), 174-81.
- ^ Катаяма, Х. и др., Rapid Commun Mass Spectrom , 2004, 18 (20), 2388-94.
- ^ Перейти обратно: а б с д Havlis, J et al., Anal Chem , 2003, 75 (6), 1300-6.
- ^ Шевченко А. и Шевченко А., Anal Biochem , 2001, 296 (2), 279-83.
- ^ Хамдан М. и др., Электрофорез , 2001, 22 (9), 1633-44.
- ^ Минеки, Р. и др., Протеомика , 2002, 2 (12), 1672-81.
- ^ Sechi, S and Chait, BT, Anal Chem , 1998, 70 (24), 5150-8.
- ^ Герберт Б. и др., Электрофорез , 2001, 22 (10), 2046-57.
- ^ Тиде, Б. и др., Rapid Commun Mass Spectrom , 2000, 14 (6), 496-502.
- ^ Вайда Т. и Гарай А. Дж. Inorg Biochem , 1981, 15 (4), 307-15.
- ^ Сипос, Т. и Меркель, младший, Биохимия , 1970, 9 (14), 2766-75.
- ^ Райс, Р.Х. и др., Журнал биохимии и биофизики , 1977, 492 (2), 316-321.
- ^ Finehout, EJ et al., Proteomics , 2005, 5 (9), 2319-21.
- ^ Перейти обратно: а б Михальски В.П. и Шил Б.Дж., Analytica Chimica Acta , 1999, 383(1-2), 27-46.
- ^ Джекель, П.А. и др., Anal Biochem , 1983, 134(2), 347-54.
- ^ Паттерсон, С.Д., Электрофорез , 1995, 16 (7), 1104-14.
- ^ Перейти обратно: а б Шелер С. и др., Электрофорез , 1998, 19 (6), 918-27.
- ^ Хумар, Дж. и Драпо, Г.Р., Proc Natl Acad Sci USA , 1972, 69 (12), 3506-9.
- ^ Фара, Массачусетс и др., Biochim Biophys Acta , 2005, 1725 (3), 269-82.
- ^ Ван Л. и др., Pharm Res , 2005, 22 (8), 1338-49.
- ^ Нонака, Т; Ю. Хасимото; К. Такио (1998). «Кинетическая характеристика лизин-специфичных металлоэндопептидаз из плодовых тел Grifola frondosa и Pleurotus ostreatus». Журнал биохимии . 124 (1): 157–162. doi : 10.1093/oxfordjournals.jbchem.a022074 . ISSN 0021-924X . ПМИД 9644258 .
- ^ Тауатас, Надя; Мадалина М. Друган; Альберт Дж. Р. Хек; Шабаз Мохаммед (2008). «Простое лестничное секвенирование пептидов с использованием металлоэндопептидазы Lys-N». Нат-методы . 5 (5): 405–407. дои : 10.1038/nmeth.1204 . ISSN 1548-7091 . ПМИД 18425140 . S2CID 28504546 .
- ^ Чоудхари, Дж. и др., J Proteome Res , 2003, 2 (1), 59-67.
- ^ Wa, C и др., Anal Biochem , 2006, 349 (2), 229-41.
- ^ Файнхаут, Э.Дж. и Ли, К.Х., Электрофорез , 2003, 24 (19-20), 3508-16.
- ^ Erdjument-Bromage, H et al., J Chromatogr A , 1998, 826 (2), 167-81.
- ^ Стюарт II и др., Rapid Commun Mass Spectrom , 2001, 15 (24), 2456-65.
- ^ Хаутхейв Т. и др., Журнал белковой химии , 1997, 16 (5), 343-348.
- ^ Канелле Л. и др., Быстрая связь в масс-спектрометрии , 2004, 18 (23), 2785–2794.
- ^ Стед, Д.А. и др., Brief Bioinform , 2008 г.
- ^ Ху, Дж. и др., Brief Funct Genomic Proteomic , 2005, 3 (4), 322-31.
Внешние ссылки
[ редактировать ]- Флэш-фильм, иллюстрирующий экспериментальную процедуру оптимизированного расщепления в геле, как описано Granvogl et al.