Зимография
Зимография — это электрофоретический метод обнаружения гидролитических ферментов , основанный на репертуаре субстратов фермента. Используются три типа зимографии; в гель -зимографии, зимографии in situ и зимографии in vivo . [2] Например, желатин , внедренный в полиакриламидный гель, будет перевариваться активными желатиназами, проходящим через гель. После окрашивания Кумасси участки деградации видны в виде четких полос на темном фоне. [3]
Современное использование термина зимография было адаптировано для определения изучения и каталогизации ферментированных продуктов, таких как пиво или вино, часто конкретными пивоварами или виноделами или в пределах определенной категории ферментации, например, с использованием определенного штамма дрожжей или видов бактерий. . [ нужна ссылка ] Зимография также относится к набору связанных ферментированных продуктов, рассматриваемых как произведение. Например, все сорта пива, производимые конкретной пивоварней, можно вместе назвать ее зимографией. [ нужна ссылка ]
См. также Зимологию или прикладную науку зимографии. Зимология относится к биохимическим процессам брожения, особенно к выделению ферментирующих дрожжей и бактерий в пивоварении, виноделии и других ферментированных продуктах. Например, производство пива предполагает применение дрожжей верхового (эль) или низового брожения (лагер) для производства желаемого сорта пива. Синтез дрожжей может повлиять на вкусовой профиль пива, т.е. на диацетил (вкус или аромат масла, ириски).
Гель-зимография
[ редактировать ]Образцы готовятся в стандартном невосстанавливающем загрузочном буфере для SDS-PAGE . Никакого восстановителя или кипячения не требуется, поскольку они могут помешать повторному сворачиванию фермента. Подходящий субстрат (например, желатин или казеин для обнаружения протеаз) внедряют в разделяющий гель во время приготовления акриламидного геля . После электрофореза ДСН зимограммы удаляют из геля (или с последующей инкубацией в подходящем буфере для ) путем инкубации в небуферном Тритоне Х-100 расщепления в течение оптимального периода времени при 37 °С. Впоследствии зимограмму окрашивают (обычно амидо-черным или кумасси-бриллиантовым синим ), и участки пищеварения выглядят как четкие полосы на темном фоне, где субстрат разрушен ферментом.
Вариации стандартного протокола
[ редактировать ]Стандартный протокол может потребовать изменений в зависимости от фермента образца; например, D. melanogaster пищеварительные гликозидазы обычно выдерживают восстанавливающие условия (т.е. присутствие 2-меркаптоэтанола или DTT ) и, в некоторой степени, нагревание. Действительно, разделение после нагревания до 50 °C имеет тенденцию демонстрировать существенное увеличение разрешения полос без заметной потери активности. [4] [5]
Обычным протоколом, использовавшимся в прошлом для зимографии активности α-амилазы, был так называемый протокол крахмальной пленки У. В. Доана. Здесь для разделения белков в гомогенате использовали нативный гель PAGE. Впоследствии тонкий гель с растворенным в нем крахмалом (или, точнее, суспендированным) на некоторое время накладывался поверх исходного геля. [6] Затем крахмал окрашивали йодом Люголя.
Гель-зимографию часто используют для обнаружения и анализа ферментов, продуцируемых микроорганизмами. [7] Это привело к вариациям стандартного протокола, например, зимографии со смешанным субстратом. [2]
Обратная зимография сополимеризует как субстрат, так и фермент с акриламидом и полезна для демонстрации активности ингибитора фермента . После окрашивания области ингибирования визуализируются как темные полосы на прозрачном (или слегка окрашенном) фоне.
В методе импринтинга фермент отделяют с помощью электрофореза в нативном геле , и гель наносят поверх агарозы, обработанной субстратом . [1]
Зимографию можно также применять к другим типам ферментов, включая ксиланазы , липазы и хитиназы.
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Перейти обратно: а б Хемпельманн, Э.; Путфаркен, Б.; Рангачари, К.; Уилсон, RJM (1986). «Иммунопреципитация малярийной кислой эндопептидазы». Паразитология . 92 (2): 305–312. дои : 10.1017/S0031182000064076 . ПМИД 3520446 . S2CID 42414630 .
- ^ Перейти обратно: а б Вандоорен Дж., Гертс Н., Мартенс Э., Ван ден Стин П.Е., Опденаккер Г. (2013). «Зимографические методы визуализации гидролитических ферментов». Нат-методы . 10 (3): 211–220. дои : 10.1038/nmeth.2371 . ПМИД 23443633 . S2CID 5314901 .
- ^ «Протокол желатиновой зимографии | Abcam» . www.abcam.com . Проверено 12 мая 2017 г.
- ^ Мартинес Т.Ф., Аларкон Ф.Дж., Диас-Лопес М., Мояно Ф.Дж. (2000). «Улучшенное обнаружение активности амилазы с помощью электрофореза в полиакриламидном геле додецилсульфата натрия с сополимеризованным крахмалом». Электрофорез . 21 (14): 2940–2943. doi : 10.1002/1522-2683(20000801)21:14<2940::AID-ELPS2940>3.0.CO;2-S . ПМИД 11001307 . S2CID 30732170 .
- ^ Снук-ван Берден П.А., Фон ден Хофф Дж.В. (2005). «Зимографические методы анализа матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов» . БиоТехники . 38 (1): 73–83. дои : 10.2144/05381RV01 . hdl : 2066/47379 . ПМИД 15679089 .
- ^ Доан WW (1969). «Варианты амилазы у Drosophila melanogaster: исследования сцепления и характеристика ферментных экстрактов». J Exp Зоол . 171 (3): 31–41. Бибкод : 1969JEZ...171..321D . дои : 10.1002/jez.1401710308 . ПМИД 5348624 .
- ^ Ланц М.С., Циборовский П. (1994). «Зимографические методы обнаружения и характеристики микробных протеаз» . Бактериальный патогенез. Часть A: Идентификация и регулирование факторов вирулентности . Методы энзимологии. Том. 235. С. 563–594 . дои : 10.1016/0076-6879(94)35171-6 . ISBN 9780121821364 . ПМИД 8057927 .