Изоэлектрическая фокусировка
Изоэлектрофокусирование ( ИЭФ ), также известное как электрофокусирование , представляет собой метод разделения различных молекул по различиям в их изоэлектрической точке (pI). [1] [2] Это тип зонного электрофореза, который обычно проводится на белках в геле , в котором используется тот факт, что общий заряд интересующей молекулы является функцией pH ее окружения. [3]
Процедура
[ редактировать ]ИЭФ включает добавление раствора амфолита в гели с иммобилизованным градиентом pH (IPG). IPG представляют собой матрицу акриламидного геля, сополимеризованную с градиентом pH, что приводит к полностью стабильным градиентам, за исключением самых щелочных (>12) значений pH. Иммобилизованный градиент pH получается путем непрерывного изменения соотношения иммобилинов . Иммобилин представляет собой слабую кислоту или основание, определяемое значением его pK.
Белок, уровень pH которого ниже его изоэлектрической точки (pI), будет заряжен положительно и поэтому будет мигрировать к катоду (отрицательно заряженному электроду). Однако по мере того, как он мигрирует по градиенту увеличения pH, общий заряд белка будет уменьшаться до тех пор, пока белок не достигнет области pH, соответствующей его pI. В этот момент он не имеет суммарного заряда, и поэтому миграция прекращается (поскольку нет электрического притяжения ни к одному из электродов). В результате белки фокусируются в резкие стационарные полосы, причем каждый белок располагается в точке градиента pH, соответствующей его pI. Этот метод обеспечивает чрезвычайно высокое разрешение, когда белки, различающиеся одним зарядом, фракционируются на отдельные полосы.
Молекулы, подлежащие фокусировке, распределяются в среде, имеющей градиент pH (обычно создаваемый алифатическими амфолитами ). Электрический ток пропускается через среду, создавая «положительный» анод и «отрицательный» катод . Отрицательно заряженные молекулы мигрируют через градиент pH в среде к «положительному» концу, тогда как положительно заряженные молекулы движутся к «отрицательному» концу. Когда частица движется к полюсу, противоположному ее заряду, она движется через изменяющийся градиент pH, пока не достигнет точки, в которой достигается pH изоэлектрической точки этой молекулы. В этот момент молекула больше не имеет суммарного электрического заряда (из-за протонирования или депротонирования связанных функциональных групп) и, как таковая, не будет двигаться дальше внутри геля. Градиент устанавливается перед добавлением интересующих частиц, сначала подвергая раствор небольших молекул, таких как полиамфолиты, электрофорезу с различными значениями pI.
Особенно часто метод применяется при исследовании белков , которые разделяются по относительному содержанию в них кислотных и основных остатков , величина которых представлена индексом pI. Белки вводят в иммобилизованный гель с градиентом pH, состоящий из полиакриламида , крахмала или агарозы , где установлен градиент pH. В этом процессе обычно используются гели с большими порами, чтобы устранить любые эффекты «просеивания» или артефакты в pI, вызванные разными скоростями миграции белков разного размера. Изоэлектрическое фокусирование позволяет разделить белки, значения pI которых различаются всего на 0,01. [4] Изоэлектрическое фокусирование — это первый этап двумерного гель-электрофореза , при котором белки сначала разделяются по значению pI, а затем дополнительно разделяются по молекулярной массе с помощью SDS-PAGE . С другой стороны, изоэлектрическое фокусирование является единственным этапом препаративного нативного ПААГ при постоянном pH. [5]
Живые клетки
[ редактировать ]По некоторым мнениям, [6] [7] живые эукариотические клетки осуществляют изоэлектрическую фокусировку белков внутри себя, чтобы преодолеть ограничение скорости метаболических реакций за счет диффузии ферментов и их реагентов, а также регулировать скорость определенных биохимических процессов. Концентрируя ферменты определенных метаболических путей в отдельных и небольших областях своей внутренней части, клетка может увеличить скорость определенных биохимических путей на несколько порядков. Модифицируя изоэлектрическую точку (pI) молекул фермента, например, путем фосфорилирования или дефосфорилирования, клетка может переносить молекулы фермента между различными частями своего внутреннего пространства, включая или выключая определенные биохимические процессы.
На основе микрофлюидного чипа
[ редактировать ]Электрофорез на основе микрочипа является многообещающей альтернативой капиллярному электрофорезу , поскольку он потенциально может обеспечить быстрый анализ белков, прямую интеграцию с другими операциями микрофлюидного устройства, обнаружение всего канала, нитроцеллюлозные пленки, меньшие размеры образцов и более низкие затраты на производство.
Многопереходный
[ редактировать ]Возросший спрос на более быстрые и простые в использовании инструменты для разделения белков ускорил развитие IEF в сторону разделения в растворе. В связи с этим была разработана многопереходная система ИЭФ для быстрого и безгелевого разделения ИЭФ. В многосоставной системе ИЭФ используется ряд сосудов, через каждый из которых проходит капилляр. [8] Часть капилляра в каждом сосуде заменена полупроницаемой мембраной. Сосуды содержат буферные растворы с разными значениями pH, поэтому внутри капилляра эффективно устанавливается градиент pH. Буферный раствор в каждом сосуде имеет электрический контакт с делителем напряжения, подключенным к источнику питания высокого напряжения, который создает электрическое поле вдоль капилляра. Когда образец (смесь пептидов или белков) вводится в капилляр, наличие электрического поля и градиента pH разделяет эти молекулы по их изоэлектрическим точкам. Многопереходная система IEF использовалась для разделения смесей триптических пептидов для двумерной протеомики. [9] и белки плазмы крови пациентов с болезнью Альцгеймера для открытия биомаркеров. [8]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Бьеллквист, Бенгт; Эк, Кристина; Ригетти, Пьер Джорджо; Джанацца, Элизабетта; Гёрг, Анжелика; Вестермайер, Райнер; Постель, Вильгельм (1982). «Изоэлектрическое фокусирование в иммобилизованных градиентах pH: принцип, методология и некоторые приложения». Журнал биохимических и биофизических методов . 6 (4): 317–339. дои : 10.1016/0165-022X(82)90013-6 . ISSN 0165-022X . ПМИД 7142660 .
- ^ Пьер Джорджио Ригетти (1 апреля 2000 г.). Изоэлектрическая фокусировка: теория, методология и применение . Эльзевир. ISBN 978-0-08-085880-7 .
- ^ Дэвид Эдвард Гарфин (1990). Изоэлектрическая фокусировка . Методы энзимологии. Том. 182. стр. 459–77. дои : 10.1016/0076-6879(90)82037-3 . ISBN 9780121820831 . ПМИД 2314254 .
- ^ Страйер, Люберт: «Биохимия», стр. 50. Spektrum Akademischer Verlag, 1996 (немецкий)
- ^ Кастенхольц, Б (2004). «Препаративный непрерывный электрофорез в нативном полиакриламидном геле (PNC-PAGE): эффективный метод выделения кофакторов кадмия в биологических системах». Аналитические письма . 37 (4). Информа Великобритания Лимитед: 657–665. дои : 10.1081/al-120029742 . ISSN 0003-2719 . S2CID 97636537 .
- ^ Флегр Дж (1990). «Осуществляет ли клетка изоэлектрическую фокусировку?» (PDF) . БиоСистемы . 24 (2): 127–133. дои : 10.1016/0303-2647(90)90005-Л . ПМИД 2249006 .
- ^ Баскин Э.Ф.; Букшпан С; Зильберштейн Г.В. (2006). «РН-индуцированный внутриклеточный транспорт белков». Физическая биология . 3 (2): 101–106. Бибкод : 2006PhBio...3..101B . дои : 10.1088/1478-3975/3/2/002 . ПМИД 16829696 . S2CID 41599078 .
- ^ Jump up to: а б Пирморадян М.; Асторга-Уэллс, Дж.; Зубарев, РА. (2015). «Многопереходное капиллярное изоэлектрическое фокусирующее устройство в сочетании с онлайн-мембранным буферным обменником позволяет фракционировать изоэлектрическую точку интактных белков плазмы человека для открытия биомаркеров» (PDF) . Аналитическая химия . 87 (23): 11840–11846. дои : 10.1021/acs.analchem.5b03344 . hdl : 10616/44920 . ПМИД 26531800 .
- ^ Пирморадян, М.; Чжан, Б.; Чингин, К.; Асторга-Уэллс, Дж.; Зубарев Р.А. (2014). «Устройство изоэлектрической фокусировки с мембраной в качестве микропрепаративного фракционатора для двумерной протеомики дробовика». Аналитическая химия . 86 (12): 5728–5732. дои : 10.1021/ac404180e . ПМИД 24824042 .
