Анализ бицинхониновой кислоты

Анализ бицинхониновой кислоты ( анализ BCA ), также известный как анализ Смита , в честь его изобретателя Пола К. Смита из Pierce Chemical Company . ^[1] теперь являющийся частью Thermo Fisher Scientific, представляет собой биохимический анализ для определения общей концентрации белка в растворе (от 0,5 мкг/мл до 1,5 мг/мл), аналогичный анализу белка Лоури , анализу белка Брэдфорда или биуретовому реагенту . Общая концентрация белка проявляется в изменении цвета раствора образца с синего на фиолетовый пропорционально концентрации белка, которую затем можно измерить с помощью колориметрических методов. Анализ BCA был запатентован компанией Pierce Chemical Company в 1989 году, срок действия патента истек в 2006 году. ^[2]

Механизм

Стандартный раствор BCA содержит следующие ингредиенты в сильнощелочном растворе с pH 11,25: бицинхониновая кислота , карбонат натрия , бикарбонат натрия , тартрат натрия и пентагидрат сульфата меди (II) .

Анализ BCA в основном основан на двух реакциях. Во-первых, пептидные связи в белке восстанавливают Cu ²⁺ ионы от сульфата меди(II) до Cu ¹⁺ (реакция, зависящая от температуры). Количество Cu ²⁺ Снижение пропорционально количеству белка, присутствующего в растворе. Затем две молекулы бицинхониновой кислоты хелатируются с каждой Cu. ¹⁺ ион , образующий комплекс фиолетового цвета, сильно поглощающий свет с длиной волны 562 нм .

Бицинхониновая кислота Cu ¹⁺ В образцах белков на комплекс влияет наличие боковых цепей цистеина/цистина, тирозина и триптофана. При более высоких температурах (от 37 до 60 °C) пептидные связи способствуют образованию реакционного комплекса. Инкубация анализа BCA при более высоких температурах рекомендуется как способ повышения чувствительности анализа и минимизации отклонений, вызванных неодинаковым аминокислотным составом. ^[3]

Количество белка, присутствующего в растворе, можно определить количественно путем измерения спектров поглощения и сравнения с растворами белков известной концентрации.

Ограничения

Анализ BCA практически несовместим с восстановителями и хелаторами металлов, хотя их следовые количества допустимы. ^[4] Сообщается, что анализ BCA также реагирует на общие мембранные липиды и фосфолипиды. ^[5]

Варианты анализа

Существует несколько альтернативных вариантов анализа BCA:

Оригинальный анализ BCA

Как описывает Смит, ^[1] оригинальный анализ BCA представляет собой двухкомпонентный протокол. Оба реагента «стабильны неопределенно долго при комнатной температуре». ^[1] Современные (вероятно, точные или очень похожие) составы доступны как минимум у двух коммерческих поставщиков. ^[6]^[7] Рабочий раствор BCA получается путем смешивания реагента A и реагента B в соотношении 50:1, и его можно готовить либо еженедельно (он умеренно стабилен), либо по мере необходимости.

Реагент А ^[1]

1% мас./об. BCA-Na ₂ (CAS: 979-88-4)
2% мас./об. Na ₂ CO ₃ ·H ₂ O (CAS: 5968-11-6)
0,16% мас./об. Na ₂ тартрата (CAS: 868-18-8)
0,4% мас./об. NaOH (CAS: 1310-73-2)
0,95% мас./об. NaHCO ₃ (CAS: 144-55-8)
Добавьте 50% NaOH или твердый NaHCO _3, чтобы довести pH до 11,25.

Предлагаемая, но непроверенная альтернативная формулировка в рукописи Смита состоит в том, чтобы исключить NaOH (и, предположительно, не выполнять ручную корректировку pH до 11,25), а вместо этого растворить другие компоненты в заранее приготовленном буфере , состоящем из 0,25 М Na ₂ CO ₃ и 0,01 М. NaHCO ₃ . ^[1]

Смит синтезировал свой собственный BCA с помощью реакции Пфитцингера изатина Примечательно, что и ацетоина , заменив КОН NaOH, но в остальном следуя синтетическому методу Лесена и Хенце. ^[8] поскольку BCA, доступный у коммерческих поставщиков того времени, был слишком нечистым для их использования. Потребовалось как минимум три последовательные перекристаллизации синтезированного ими БСА из воды с температурой 70°С, чтобы достаточно очистить его для анализа. ^[1]

Реагент Б ^[1]

4% w/v CuSO ₄·5H ₂O

Анализ Micro BCA (для разбавленных растворов)

Анализ BCA Micro BCA представляет собой трехкомпонентный протокол, в котором используются концентрированные запасы реагентов биуретовой реакции , BCA и меди(II) . Это позволяет повысить чувствительность примерно на 2–40 мкг/мл по сравнению с 20–2000 мкг/мл исходного анализа BCA. Однако у него другое и, вообще говоря, более чувствительное вмешательство со стороны небелковых компонентов. ^[4] Наборы для анализа Micro BCA доступны как минимум у двух коммерческих поставщиков. ^[9]^[10] Примечательно, что состав и использование «Реагента и протокола Micro BCA» были описаны в оригинальной рукописи Смитом. ^[1] и современные наборы, вероятно, состоят из точного или очень похожего состава. Протокол состоит из смешивания микрореагента B и раствора меди 25:1 с получением микрореагента C (MC), который не является стабильным при хранении и должен быть свежеприготовленным, а затем смешивания MC 1:1 с микрореагентом A для получения получить окончательный (также нестабильный) рабочий раствор для анализа. Микрореагент А, микрореагент Б и раствор меди стабильны неопределенно долго при комнатной температуре. ^[1]

Микрореагент А (МА) ^[1]

8% мас./об. Na ₂ CO ₃ ·H ₂ O (CAS: 5968-11-6)
1,6% мас./об. NaOH (CAS: 1310-73-2)
1,6% мас./об. Na ₂ тартрата (CAS: 868-18-8) (10-кратная концентрация реагента А в исходном анализе BCA выше )
Достаточное количество NaHCO ₃ (CAS: 144-55-8) для доведения pH до 11,25.

Микрореагент Б (МБ) ^[1]

4% мас./об. BCA-Na ₂ (CAS: 979-88-4) (4-кратная концентрация реагента А в исходном анализе BCA выше )

Медный раствор ^[1]

4% мас./об. CuSO ₄ ·5H ₂ O (CAS: 7758-99-8) (та же концентрация, что и у реагента B в исходном анализе BCA выше )

Анализ BSA на совместимость с восстанавливающим агентом (RAC)

Этот тип анализа BCA включает запатентованный тиол-ковалентный блокирующий «Реагент совместимости». ^[11] он же агент совместимости восстановителя (RACA). ^[12] Хотя это обеспечивает большую совместимость с восстановителями, анализ имеет профиль помех, отличный от других небелковых компонентов. ^[4]

Рапид Голд БСА

Похоже, что этот тип анализа BCA доступен только у Thermo Fisher Scientific . Сообщается, что он использует «тот же метод восстановления меди, что и традиционный анализ белка BCA, с уникальным [запатентованным] хелатором меди», который поглощает при 480 нм вместо 562 нм. ^[13] Этот запатентованный хелатор и предположительно оптимизированная рецептура биуретовой реакции позволяют анализу давать быстрые (<5 минут) результаты без инкубации при 37˚C+, как в оригинальном анализе BCA. Однако этот анализ имеет профиль взаимодействия, отличный от других небелковых компонентов. ^[4] В количественном колориметрическом пептидном анализе Пирса (теперь принадлежащем и доступном у Thermo Fisher Scientific), по-видимому, используется аналогичный или идентичный запатентованный хелатор меди, поглощающий длину волны 480 нм. ^[14]

См. также

Ссылки

^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час ^я ^дж ^к ^л Смит, ПК; и др. (1985). «Измерение белка с использованием бицинхониновой кислоты». Анальный. Биохим . 150 (1): 76–85. дои : 10.1016/0003-2697(85)90442-7 . ПМИД 3843705 .
^ «US4839295A - Измерение белка с использованием бицинхониновой кислоты» . Гугл Патенты . 26 мая 1987 г. Проверено 9 апреля 2023 г.
^ Олсен Б.Дж., Марквелл Дж. (2007). «Анализы для определения концентрации белка» (PDF) . Текущие протоколы в науке о белках : 14–17.
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д Фишер Сайентифик, Термо. «Таблица совместимости анализов количественного определения белка» (PDF) . Проверено 19 апреля 2023 г.
^ Кесслер, Ральф Дж.; Фанестил, Даррелл Д. (1986). «Вмешательство липидов в определение белка с использованием бицинхониновой кислоты». Аналитическая биохимия . 159 (1). Эльзевир Б.В.: 138–142. дои : 10.1016/0003-2697(86)90318-0 . ISSN 0003-2697 . ПМИД 3812993 .
^ Фишер Сайентифик, Термо. «Набор для анализа белка Pierce BCA — Руководство пользователя» (PDF) . Проверено 22 апреля 2023 г.
^ Биологические науки, G-. «Анализ белка бицинхониновой кислоты (BCA) — Руководство пользователя» (PDF) . Проверено 22 апреля 2023 г.
^ Лесен, Шерман Д.; Хенце, Генри Р. (1942). «Использование алкоксикетонов в синтезе хинолинов реакцией Пфитцингера. II1». Журнал Американского химического общества . 64 (8). Американское химическое общество (ACS): 1897–1900. дои : 10.1021/ja01260a041 . ISSN 0002-7863 .
^ Фишер Сайентифик, Термо. «Набор для анализа белка Micro BCA — инструкции» (PDF) . Проверено 22 апреля 2023 г.
^ Биологические науки, G-. «Анализ белка микробицинхониновой кислоты (BCA) — Руководство пользователя» (PDF) .
^ Фишер Сайентифик, Термо. «Набор для анализа белка Pierce Microplate BCA-RAC — Руководство пользователя» (PDF) . Проверено 22 апреля 2023 г.
^ Биологические науки, G-. «Анализ белка, совместимого с восстанавливающим агентом бицинхониновой кислоты (BCA) - Руководство пользователя» (PDF) . Проверено 22 апреля 2023 г.
^ Фишер Сайентифик, Термо. «Набор для анализа белка BCA Pierce Rapid Gold — Руководство пользователя» (PDF) . Проверено 22 апреля 2023 г.
^ Фишер Сайентифик, Термо. «Количественный колориметрический анализ пептидов Пирса - Руководство пользователя» (PDF) . Термо Фишер Сайентифик . Проверено 19 июля 2023 г.

Вихельман, К.; Браун Р. и Фитцпатрик Дж. (1988). «Исследование белка бицинхониновой кислоты: идентификация групп, ответственных за образование цвета». Анальный. Биохим . 175 (1): 231–7. дои : 10.1016/0003-2697(88)90383-1 . ПМИД 3245570 .
Стосчек, CM. (1990). «6». Количественное определение белка . Методы энзимологии. Том. 182. стр. 50–69. дои : 10.1016/0076-6879(90)82008-П . ISBN 9780121820831 . ПМИД 2314256 .

Внешние ссылки

[smith85-1] Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час ^я ^дж ^к ^л Смит, ПК; и др. (1985). «Измерение белка с использованием бицинхониновой кислоты». Анальный. Биохим . 150 (1): 76–85. дои : 10.1016/0003-2697(85)90442-7 . ПМИД 3843705 .

[Google_Patents_1987-2] «US4839295A - Измерение белка с использованием бицинхониновой кислоты» . Гугл Патенты . 26 мая 1987 г. Проверено 9 апреля 2023 г.

[3] Олсен Б.Дж., Марквелл Дж. (2007). «Анализы для определения концентрации белка» (PDF) . Текущие протоколы в науке о белках : 14–17.

[ThermoProteinQuantitationAssayCompatibilityTable-4] Jump up to: ^а ^б ^с ^д Фишер Сайентифик, Термо. «Таблица совместимости анализов количественного определения белка» (PDF) . Проверено 19 апреля 2023 г.

[KF86-5] Кесслер, Ральф Дж.; Фанестил, Даррелл Д. (1986). «Вмешательство липидов в определение белка с использованием бицинхониновой кислоты». Аналитическая биохимия . 159 (1). Эльзевир Б.В.: 138–142. дои : 10.1016/0003-2697(86)90318-0 . ISSN 0003-2697 . ПМИД 3812993 .

[6] Фишер Сайентифик, Термо. «Набор для анализа белка Pierce BCA — Руководство пользователя» (PDF) . Проверено 22 апреля 2023 г.

[7] Биологические науки, G-. «Анализ белка бицинхониновой кислоты (BCA) — Руководство пользователя» (PDF) . Проверено 22 апреля 2023 г.

[Lesesne_Henze_1942_pp._1897–1900-8] Лесен, Шерман Д.; Хенце, Генри Р. (1942). «Использование алкоксикетонов в синтезе хинолинов реакцией Пфитцингера. II1». Журнал Американского химического общества . 64 (8). Американское химическое общество (ACS): 1897–1900. дои : 10.1021/ja01260a041 . ISSN 0002-7863 .

[9] Фишер Сайентифик, Термо. «Набор для анализа белка Micro BCA — инструкции» (PDF) . Проверено 22 апреля 2023 г.

[10] Биологические науки, G-. «Анализ белка микробицинхониновой кислоты (BCA) — Руководство пользователя» (PDF) .

[11] Фишер Сайентифик, Термо. «Набор для анализа белка Pierce Microplate BCA-RAC — Руководство пользователя» (PDF) . Проверено 22 апреля 2023 г.

[12] Биологические науки, G-. «Анализ белка, совместимого с восстанавливающим агентом бицинхониновой кислоты (BCA) - Руководство пользователя» (PDF) . Проверено 22 апреля 2023 г.

[13] Фишер Сайентифик, Термо. «Набор для анализа белка BCA Pierce Rapid Gold — Руководство пользователя» (PDF) . Проверено 22 апреля 2023 г.

[14] Фишер Сайентифик, Термо. «Количественный колориметрический анализ пептидов Пирса - Руководство пользователя» (PDF) . Термо Фишер Сайентифик . Проверено 19 июля 2023 г.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]

[13]

[14]