TCP-последовательность
Секвенирование профиля комплекса трансляции ( TCP-seq ) — это метод молекулярной биологии , позволяющий получить снимки мгновенного распределения комплексов синтеза белка вдоль цепей информационной РНК (мРНК). [1]
Приложение
[ редактировать ]Экспрессия генетического кода во всех формах жизни состоит из двух основных процессов: синтеза копий генетического кода, записанного в ДНК, в форму мРНК ( транскрипция ) и самого синтеза белка ( трансляция ), при котором копии кода в мРНК декодируются в аминокислотные последовательности соответствующих белков. И транскрипция, и трансляция — это строго регулируемые процессы, по существу контролирующие все, что происходит в живых клетках (и, следовательно, в многоклеточных организмах).
Контроль трансляции особенно важен в эукариотических клетках, где он является частью посттранскрипционной регуляторной сети экспрессии генов. Эта дополнительная функциональность отражается на увеличении сложности процесса перевода , что делает его трудным для исследования. Однако подробности о том, когда и какая мРНК транслируется и какие механизмы отвечают за этот контроль, являются ключом к пониманию нормального и патологического функционирования клеток. TCP-seq можно использовать для получения этой информации.
Принципы
[ редактировать ]С появлением высокопроизводительных методов идентификации последовательностей ДНК и РНК (таких как секвенирование Illumina ) стало возможным эффективно анализировать нуклеотидные последовательности большого количества относительно коротких фрагментов ДНК и РНК. Последовательности этих фрагментов можно накладывать друг на друга, чтобы восстановить источник. Альтернативно, если исходная последовательность уже известна, фрагменты можно найти внутри нее («сопоставить») и подсчитать их отдельные номера. Таким образом, если существует начальная стадия, на которой фрагменты по-разному присутствуют или выбираются («обогащены»), этот подход можно использовать для количественного описания такой стадии даже для очень большого количества или длины входных последовательностей, чаще всего охватывающих всю ДНК. или РНК клетки.
TCP-seq основан на этих возможностях высокопроизводительного секвенирования РНК и дополнительно использует феномен защиты нуклеиновых кислот . Защита проявляется в устойчивости к деполимеризации или модификации участков нуклеиновых кислот (в частности, РНК), которые прочно связаны с другими биомолекулами или поглощены ими, оставляя таким образом свои «следы» на цепи нуклеиновой кислоты. Таким образом, эти фрагменты «следа» представляют собой место в цепи нуклеиновой кислоты, где происходит взаимодействие. Путем секвенирования и сопоставления фрагментов с исходной последовательностью можно точно определить расположение и количество этих межмолекулярных контактов.
В случае TCP-seq рибосомы и рибосомальные субъединицы, участвующие во взаимодействии с мРНК, сначала быстро химически сшиваются с ней формальдегидом, чтобы сохранить существующее состояние взаимодействий («моментальный снимок» распределения) и заблокировать возможные неравновесные процессы. Сшивание можно осуществлять непосредственно в живых клетках, но не ограничиваясь ими. Затем РНК частично разрушается ( например, с помощью рибонуклеазы ), так что остаются только фрагменты, защищенные рибосомами или рибосомальными субъединицами. Защищенные фрагменты затем очищаются в соответствии с динамикой седиментации прикрепленных рибосом или рибосомальных субъединиц, деблокируются, секвенируются и картируются с исходным транскриптомом , определяя исходное расположение комплексов трансляции на мРНК.
TCP-seq объединяет несколько элементов, типичных для других анализов транскриптома подобных . В частности, профилирование полисом [2] [3] и профилирование рибосом (трансляции) [4] подходы также используются для идентификации мРНК, участвующей в формировании полисом , и местоположения удлиняющихся рибосом в кодирующих областях транскриптов соответственно. Однако эти методы не используют химическую стабилизацию комплексов трансляции и очистку ковалентно связанных интермедиатов из живых клеток. Таким образом, TCP-seq можно рассматривать скорее как функциональный эквивалент ChIP-seq и подобных методов исследования мгновенных взаимодействий ДНК, которые переработаны для применения в целях трансляции.
Преимущества и недостатки
[ редактировать ]К преимуществам метода относятся:
- уникально широкое поле зрения (поскольку впервые захватываются комплексы трансляции любого типа, в том числе сканирование малых субъединиц рибосом);
- потенциально более естественное представление сложной динамики (поскольку все, а не только избранные, процессы трансляции останавливаются фиксацией формальдегида);
- возможно, более точное и/или чувствительное обнаружение местоположения комплексов трансляции (поскольку ковалентная фиксация предотвращает отслоение фрагментов от рибосом или их субъединиц).
К недостаткам относятся:
- более высокая общая сложность экспериментальной процедуры (из-за необходимости первоначального выделения транслируемой мРНК и препаративной седиментации для разделения рибосом и рибосомальных субъединиц);
- более высокое загрязнение полезной глубины считывания секвенирования нежелательными фрагментами рибосомальной РНК (унаследованное от широкого окна выбора размера, используемого для защищенных фрагментов РНК);
- предварительное требование по оптимизации процедуры фиксации формальдегидом для каждого нового типа клеток или образца (поскольку оптимальное время фиксации формальдегида сильно зависит от морфологии образца, и как чрезмерная, так и недостаточная фиксация могут поставить под угрозу результаты).
Разработка
[ редактировать ]Этот метод в настоящее время разрабатывается и применяется для исследования динамики трансляции в живых дрожжевых клетках и расширяет, а не просто объединяет возможности предыдущих методов. [1] Единственным другим полнотранскриптомным методом картирования положений рибосом по мРНК с нуклеотидной точностью является профилирование рибосом (трансляция). Однако он захватывает позиции только удлиняющихся рибосом, а большинство динамичных и функционально важных интермедиатов трансляции на стадии инициации не обнаруживаются.
TCP-seq был разработан специально для устранения этих «слепых зон». По сути, он может обеспечить тот же уровень детализации фазы элонгации, что и профилирование рибосомы (трансляции), но также включает регистрацию промежуточных продуктов инициации, терминации и рециркуляции (и, по сути, любых других возможных комплексов трансляции, пока рибосома или ее субъединицы контактируют и защищают мРНК) синтеза белка, который ранее оставался недоступным. Таким образом, TCP-seq обеспечивает единый подход для полного понимания процесса трансляции биологического образца. Можно ожидать, что этот конкретный аспект метода будет развиваться дальше, поскольку динамика рибосомального сканирования мРНК во время инициации трансляции обычно неизвестна на протяжении большей части жизни. Текущий набор данных, содержащий данные TCP-seq для инициации трансляции, доступен для дрожжей Saccharomyces cerevisiae , [5] [6] и, вероятно, в будущем будет распространен на другие организмы.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Перейти обратно: а б Арчер, Стюарт К.; Широких Николай Евгеньевич; Бейльгарц, Трауде Х.; Прейсс, Томас (20 июля 2016 г.). «Динамика сканирования и рециркуляции рибосом, выявленная с помощью профилирования комплекса трансляции». Природа . 535 (7613): 570–4. Бибкод : 2016Natur.535..570A . дои : 10.1038/nature18647 . ISSN 1476-4687 . ПМИД 27437580 . S2CID 4464952 .
- ^ Масек, Томас; Валашек, Леош; Поспишек, Мартин (1 января 2011 г.). «Полисомный анализ и очистка РНК из градиентов сахарозы». РНК . Методы молекулярной биологии. Том. 703.стр. 293–309. дои : 10.1007/978-1-59745-248-9_20 . ISBN 978-1-58829-913-0 . ISSN 1940-6029 . ПМИД 21125498 .
- ^ Спангенберг, Люсия; Шигунов, Патрисия; Абуд, Ана Паула Р.; Кофре, Аксель Р.; Стимамильо, Марко А.; Кулиговский, Крисциеле; Зых, Джейса; Скиттини, Андресса В.; Коста, Александр Диас Таварес (1 сентября 2013 г.). «Профилирование полисом показывает обширную посттранскрипционную регуляцию во время дифференцировки стволовых клеток адипоцитов человека в адипоциты» . Исследования стволовых клеток . 11 (2): 902–912. дои : 10.1016/j.scr.2013.06.002 . ISSN 1876-7753 . ПМИД 23845413 .
- ^ Инголия, Николас Т.; Гаеммагами, Сина; Ньюман, Джон Р.С.; Вайсман, Джонатан С. (10 апреля 2009 г.). «Полногеномный анализ трансляции in vivo с разрешением нуклеотидов с использованием профилирования рибосом» . Наука . 324 (5924): 218–223. Бибкод : 2009Sci...324..218I . дои : 10.1126/science.1168978 . ISSN 1095-9203 . ПМЦ 2746483 . ПМИД 19213877 .
- ^ «Обозреватель данных TCP-seq» .
- ^ «Обозреватель данных перевода GWIPS-viz» .