Профилирование рибосом
Профилирование рибосом , или Ribo-Seq (также называемое отслеживанием рибосом ), представляет собой адаптацию метода, разработанного Джоан Стейтц и Мэрилин Козак почти 50 лет назад, который Николас Инголия и Джонатан Вайсман адаптировали для работы с секвенированием следующего поколения , в котором используется специализированная информационная РНК ( мРНК ) для определения того, какие мРНК активно транслируются . [ 1 ] [ 2 ] Связанный метод, который также можно использовать для определения того, какие мРНК активно транслируются, — это методология аффинной очистки трансляционных рибосом (TRAP), которая была разработана Натаниэлем Хайнцем из Университета Рокфеллера (в сотрудничестве с Полом Грингардом и Мириам Хейман). [ 3 ] [ 2 ] TRAP не включает в себя отслеживание рибосом, но предоставляет информацию, специфичную для типа клеток.
Описание
[ редактировать ]Он создает «глобальный снимок» всех рибосом, активно транслирующихся в клетке в определенный момент, известный как транслатом . Следовательно, это позволяет исследователям определить расположение сайтов начала трансляции , состав транслируемых ORF в клетке или ткани, распределение рибосом на информационной РНК и скорость трансляции рибосом. [ 4 ] Профилирование рибосом нацелено только на последовательности мРНК, защищенные рибосомой в процессе декодирования путем трансляции, в отличие от RNA-Seq , которая секвенирует всю мРНК данной последовательности, присутствующую в образце. [ 1 ] Этот метод также отличается от профилирования полисом .
История
[ редактировать ]Профилирование рибосом основано на открытии того, что мРНК внутри рибосомы можно выделить с помощью нуклеаз , которые разрушают незащищенные участки мРНК. Этот метод анализирует области мРНК, преобразуемые в белок, а также уровни трансляции каждой области, чтобы дать представление о глобальной экспрессии генов. До его разработки попытки измерить трансляцию in vivo включали микроматричный анализ РНК, выделенной из полисом , а также профилирование трансляции посредством аффинной очистки рибосом, меченных эпитопом. Это полезные и дополняющие методы, но ни один из них не позволяет получить информацию о чувствительности и положении, полученную при профилировании рибосом. [ 4 ]
Использование
[ редактировать ]Существует три основных применения профилирования рибосом: идентификация транслируемых областей мРНК, наблюдение за тем, как сворачиваются возникающие пептиды , и измерение количества синтезируемых специфических белков.
Идентификация транслируемых областей мРНК
[ редактировать ]С помощью специальных препаратов профилирование рибосом может выявить инициирующие области мРНК, области удлинения и области остановки трансляции. [ 5 ] Инициирующие области можно обнаружить путем добавления харрингтонина или лактидомицина, чтобы предотвратить дальнейшее инициирование. [ 5 ] Это позволяет анализировать стартовый кодон мРНК во всем клеточном лизате , что использовалось для определения последовательностей, отличных от AUG, которые действительно инициируют трансляцию . [ 1 ] Другие удлиненные области можно обнаружить путем добавления антибиотиков, таких как циклогексимид , который ингибирует транслокацию, хлорамфеникола , который ингибирует перенос пептидов внутри рибосомы, или немедикаментозных средств, таких как термическое замораживание. [ 5 ] Эти методы элонгационного замораживания позволяют анализировать кинетику трансляции. Поскольку несколько рибосом могут транслировать одну молекулу мРНК, чтобы ускорить процесс трансляции, RiboSeq демонстрирует кодирующие белки области внутри мРНК и то, насколько быстро это делается в зависимости от секвенируемой мРНК. [ 1 ] [ 6 ] Это также позволяет при профилировании рибосом выявить сайты пауз внутри транскриптома на определенных кодонах. [ 6 ] [ 7 ] Эти сайты медленной или приостановленной трансляции демонстрируются увеличением плотности рибосом, и эти паузы могут связывать определенные белки с их ролью в клетке. [ 1 ]
Пептидный фолдинг
[ редактировать ]Сочетание профилирования рибосом с ChIP может выяснить, как и когда сворачиваются вновь синтезированные белки. [ 1 ] Используя следы, полученные с помощью Ribo-Seq, определенные рибосомы, связанные с такими факторами, как шапероны можно очистить . Приостановка рибосомы в определенные моменты времени, позволяющая ей транслировать полипептид с течением времени, а также подвергание различных точек воздействию шаперона и осаждение с помощью ChIP очищает эти образцы и может показать, в какой момент времени пептид сворачивается. [ 1 ]
Измерение синтеза белка
[ редактировать ]Ribo-Seq также можно использовать для оценки эффективности трансляции, которая является показателем синтеза белка. Для этого приложения генерируются данные профилирования рибосом и сопоставленного секвенирования РНК. Первоначальный анализ данных может быть выполнен с помощью специальных вычислительных систем (например, [ 8 ] ). Затем эффективность трансляции можно рассчитать как заселенность рибосом каждого гена, контролируя при этом экспрессию его РНК. [ 9 ] [ 10 ] Этот подход можно сочетать с направленным разрушением белков, которые связываются с РНК, и использованием профилирования рибосом для измерения разницы в трансляции. [ 7 ] Эти разрушенные мРНК могут быть связаны с белками, сайты связывания которых уже картированы на РНК, что указывает на регуляцию. [ 1 ] [ 7 ]
Процедура
[ редактировать ]- Лизируйте клетки или ткани и изолируйте молекулы мРНК, связанные с рибосомами.
- Иммобилизируйте комплексы. Обычно это выполняют с помощью циклогексимида , но можно использовать и другие химические вещества. Также возможно отказаться от ингибиторов трансляции в условиях трансляционно-некомпетентного лизиса.
- С помощью рибонуклеаз переваривают РНК, не защищенные рибосомами.
- Изолируйте комплексы мРНК-рибосомы с помощью центрифугирования в градиенте плотности сахарозы или специализированных хроматографических колонок.
- фенолом / хлороформом от белков. Очистка смеси
- Выбор размера для ранее защищенных фрагментов мРНК.
- Лигируйте 3'-адаптер на фрагменты.
- Вычтите известные примеси рРНК (необязательно).
- Обратная транскрипция РНК в кДНК с помощью обратной транскриптазы .
- Усиливайте специфичным для каждой пряди способом.
- Последовательность читается.
- Совместите результаты секвенирования с геномной последовательностью, чтобы определить профиль трансляции. [ 11 ]
- Анализируйте полученные данные, используя вычислительные подходы, специально разработанные для профилирования рибосом. [ 12 ]
Материалы
[ редактировать ]- Комплексы РНК-рибосомы
- Циклогексимид
- Нуклеазы
- Фенол/Хлороформ
- Обратная транскриптаза
- дНТФ
- Метод секвенирования – библиотека кДНК. [ 11 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с д и ж г час Инголия NT (март 2014 г.). «Профилирование рибосом: новые взгляды на трансляцию, от отдельных кодонов до масштабов генома». Обзоры природы. Генетика . 15 (3): 205–13. дои : 10.1038/nrg3645 . ПМИД 24468696 . S2CID 13069682 .
- ^ Jump up to: а б Догерти, Джозеф Д. (13 декабря 2017 г.). «Расширяющийся набор инструментов для перевода аффинной очистки рибосом» . Журнал неврологии . 37 (50): 12079–12087. doi : 10.1523/JNEUROSCI.1929-17.2017 . ПМЦ 5729187 . ПМИД 29237735 .
- ^ Хейман М., Шефер А., Гонг С., Петерсон Дж.Д., Дэй М., Рэмси К.Е.; и др. (2008). «Подход к трансляционному профилированию для молекулярной характеристики типов клеток ЦНС» . Клетка . 135 (4): 738–48. дои : 10.1016/j.cell.2008.10.028 . ПМК 2696821 . ПМИД 19013281 .
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ Jump up to: а б Вайс Р.Б., Аткинс Дж.Ф. (декабрь 2011 г.). «Молекулярная биология. Перевод становится глобальным». Наука . 334 (6062): 1509–10. дои : 10.1126/science.1216974 . ПМИД 22174241 . S2CID 206538968 .
- ^ Jump up to: а б с Мишель А.М., Баранов П.В. (сентябрь 2013 г.). «Профилирование рибосом: монитор Hi-Def для синтеза белка в масштабе всего генома» . Междисциплинарные обзоры Wiley: РНК . 4 (5): 473–90. дои : 10.1002/wrna.1172 . ПМК 3823065 . ПМИД 23696005 .
- ^ Jump up to: а б Бускирк А.Р., Грин Р. (март 2017 г.). «Приостановка, арест и спасение рибосом у бактерий и эукариот» . Философские труды Лондонского королевского общества. Серия Б, Биологические науки . 372 (1716): 20160183. doi : 10.1098/rstb.2016.0183 . ПМК 5311927 . ПМИД 28138069 .
- ^ Jump up to: а б с Андреев Д.Е., О'Коннор П.Б., Логран Г., Дмитриев С.Е., Баранов П.В., Шацкий И.Н. (январь 2017 г.). «Понимание механизмов эукариотической трансляции, полученное с помощью профилирования рибосом» . Исследования нуклеиновых кислот . 45 (2): 513–526. дои : 10.1093/nar/gkw1190 . ПМК 5314775 . ПМИД 27923997 .
- ^ Озадам, Хакан; Гэн, Майкл; Ченик, Джан (1 мая 2020 г.). «RiboFlow, RiboR и RiboPy: экосистема для анализа данных профиля рибосом с разрешением длины чтения» . Биоинформатика . 36 (9): 2929–2931. doi : 10.1093/биоинформатика/btaa028 . ISSN 1367-4811 . ПМЦ 7203755 . ПМИД 31930375 .
- ^ Эртлин, Кристиан; Лорент, Джули; Мюри, Карл; Фурик, Люк; Тописирович, Иван; Ларссон, Ола (9 июля 2019 г.). «Общеприменимый полнотранскриптомный анализ трансляции с использованием anota2seq» . Исследования нуклеиновых кислот . 47 (12): е70. дои : 10.1093/nar/gkz223 . ISSN 1362-4962 . ПМК 6614820 . ПМИД 30926999 .
- ^ Ченик, Джан; Ченик, Элиф Саринай; Бён, Ган В.; Груберт, Фабиан; Кандилль, Софи И.; Спейсек, Дамек; Альсаллах, Билал; Тилгнер, Хаген; Арайя, Карлос Л.; Тан, Хуа; Риччи, Эмилиано (ноябрь 2015 г.). «Интегративный анализ уровней РНК, трансляции и белка выявляет явные регуляторные различия у разных людей» . Геномные исследования . 25 (11): 1610–1621. дои : 10.1101/гр.193342.115 . ISSN 1549-5469 . ПМЦ 4617958 . ПМИД 26297486 .
- ^ Jump up to: а б Инголия НТ, Гаеммагами С., Ньюман-младший, Вайсман Дж.С. (апрель 2009 г.). «Полногеномный анализ трансляции in vivo с разрешением нуклеотидов с использованием профилирования рибосом» . Наука . 324 (5924): 218–23. Бибкод : 2009Sci...324..218I . дои : 10.1126/science.1168978 . ПМЦ 2746483 . ПМИД 19213877 .
- ^ Озадам, Хакан; Гэн, Майкл; Ченик, Джан (1 мая 2020 г.). «RiboFlow, RiboR и RiboPy: экосистема для анализа данных профиля рибосом с разрешением длины чтения» . Биоинформатика . 36 (9): 2929–2931. doi : 10.1093/биоинформатика/btaa028 . ISSN 1367-4811 . ПМЦ 7203755 . ПМИД 31930375 .
Внешние ссылки
[ редактировать ]- GWIPS-браузер
- РибоГалактика
- RPF-DB. Архивировано 3 февраля 2016 г. на Wayback Machine.
- Браузер Путешествия-ВИЗ
- РибоФлоу, РибоР, РибоПи