Полисомное профилирование
Полисомное профилирование — это метод молекулярной биологии , который используется для изучения ассоциации мРНК с рибосомами . Важно отметить, что этот метод отличается от профилирования рибосом . Обе технологии были рассмотрены [ 1 ] и оба используются при анализе транслатома , но данные, которые они генерируют, имеют очень разные уровни специфичности. При использовании экспертами этот метод удивительно воспроизводим: три профиля на первом изображении взяты из трех разных экспериментов. [ 2 ]
Процедура
[ редактировать ]Процедура начинается с приготовления клеточного лизата интересующих клеток. Этот лизат содержит полисомы , моносомы (состоящие из одной рибосомы, расположенной на мРНК ), малые (40 S у эукариот ) и большие (60 S у эукариот) рибосомальные субъединицы, «свободную» мРНК и множество других растворимых клеточных компонентов.
Процедуру продолжают путем создания непрерывного градиента сахарозы с плавно изменяемой плотностью в центрифужной пробирке. В использованных концентрациях (15-45% в примере) сахароза не нарушает ассоциацию рибосом и мРНК. Часть градиента 15% находится в верхней части трубки, а часть 45% — внизу из-за их разной плотности .
Затем определенное количество (измеренное по оптической плотности ) лизата аккуратно наслаивают поверх градиента в пробирке. Лизат, хотя и содержит большое количество растворимого материала, гораздо менее плотен, чем 15% сахарозы, поэтому его можно хранить в виде отдельного слоя в верхней части пробирки, если делать это осторожно.
Для разделения компонентов лизата препарат подвергают центрифугированию. Это ускоряет компоненты лизата во много раз сильнее силы тяжести и, таким образом, продвигает их через градиент в зависимости от того, насколько «большими» являются отдельные компоненты. Маленькие (40S) субъединицы перемещаются в градиент меньше, чем большие (60S). Рибосомы 80S мРНК перемещаются дальше (обратите внимание, что вклад размера мРНК в пройденное расстояние незначителен). Полисомы, состоящие из двух рибосом, путешествуют дальше, полисомы с тремя рибосомами — еще дальше, и так далее. «Размер» компонентов обозначается S — единицей Сведберга . Обратите внимание, что один S = 10 −13 секунды, и что понятие «большой» на самом деле является чрезмерным упрощением.
После центрифугирования содержимое пробирки собирают в виде фракций сверху (меньшие, медленнее перемещающиеся) вниз (большие, более быстро движущиеся) и определяют оптическую плотность фракций. Первые удаленные фракции содержат большое количество относительно небольших молекул, таких как тРНК, отдельные белки и т. д.
Приложения
[ редактировать ]Эту технику можно использовать для изучения общей степени трансляции в клетках (например, [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] ), но его можно использовать гораздо более конкретно для изучения отдельных белков и их мРНК. Как пример, показанный в нижней части рисунка, белок, входящий в состав малой субъединицы, сначала может быть обнаружен во фракции 40S, затем почти исчезает из фракции 60S (разделения на этих градиентах не являются абсолютными), затем снова появляется. в 80S и полисомных фракциях. Это указывает на то, что в клетке обнаруживается самое большее очень мало белка, который не является частью малой субъединицы. Напротив, в верхнем ряду рисунка иммуноблота растворимый белок появляется в растворимых фракциях и связан с рибосомами и полисомами. Конкретный белок представляет собой белок-шаперон , который (вкратце) помогает сворачивать образующийся пептид при его вытеснении из рибосомы. Как и другие работы
в статье показано, что существует прямая связь шаперона с рибосомой. [ 2 ]
Этот метод также можно использовать для изучения степени трансляции определенной мРНК. [ 6 ] В этих экспериментах 5'- и 3'-последовательности мРНК исследовали на предмет их влияния на количество продуцируемой мРНК и на то, насколько хорошо мРНК транслируются. Как показано, не все изоформы мРНК транслируются с одинаковой эффективностью, хотя их кодирующие последовательности одинаковы. [ 6 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Пиччирилло, Калифорния; и др. (2014). «Трансляционный контроль иммунных ответов: от транскриптов к транслатомам» . Природная иммунология . 15 (6): 503–511. дои : 10.1038/ni.2891 . ПМИД 24840981 . S2CID 6269940 .
- ^ Jump up to: а б Ханебут, Массачусетс; и др. (2016). «Многовалентные контакты Hsp70 Ssb способствуют его архитектуре на рибосомах и зарождающемуся цепному взаимодействию» . Природные коммуникации . 7 : 13695. Бибкод : 2016NatCo...713695H . дои : 10.1038/ncomms13695 . ПМК 5150220 . ПМИД 27917864 .
- ^ Лин, CJ; и др. (2010). «Антидепрессант сертралин ингибирует инициацию трансляции, ограничивая мишень передачи сигналов рапамицина у млекопитающих» (PDF) . Исследования рака . 70 (8): 3199–3208. дои : 10.1158/0008-5472.CAN-09-4072 . ПМИД 20354178 .
- ^ Кудерт, Л; и др. (2014). «Анализ инициации трансляции в условиях стресса методом профилирования полисом» . Журнал визуализированных экспериментов (87). дои : 10.3791/51164 . ПМЦ 4193336 . ПМИД 24893838 .
- ^ Молон, М; и др. (2016). «Скорость метаболизма как фактор, определяющий продолжительность жизни дрожжей Saccharomyces cerevisiae» . Возраст (Дордрехт, Нидерланды) . 38 (1): 11. дои : 10.1007/s11357-015-9868-8 . ПМЦ 5005888 . ПМИД 26783001 .
- ^ Jump up to: а б Этаж, СН; Дудна, Дж.А. (2016). «Настраиваемый синтез белка с помощью изоформ транскриптов в клетках человека» . электронная жизнь . 5 . дои : 10.7554/eLife.10921 . ПМЦ 4764583 . ПМИД 26735365 .