Центрифугирование

Лабораторная центрифуга

Центрифугирование — это механический процесс, который включает использование центробежной силы для отделения частиц от раствора в зависимости от их размера, формы, плотности, вязкости среды и скорости ротора. Более плотные компоненты смеси мигрируют от оси центрифуги , а менее плотные компоненты смеси мигрируют к оси. Химики и биологи могут увеличить эффективную силу гравитации пробирки так, чтобы осадок (гранулы) быстро и полностью переместился на дно пробирки. Оставшаяся жидкость, лежащая над осадком, называется надосадочной жидкостью или надосадочной жидкостью.

Существует корреляция между размером и плотностью частицы и скоростью отделения частицы от гетерогенной смеси, когда единственной приложенной силой является сила тяжести. Чем больше размер и плотность частиц, тем быстрее они отделяются от смеси. При приложении к смеси большей эффективной гравитационной силы, как это делает центрифуга, разделение частиц ускоряется. Это идеально подходит для промышленных и лабораторных условий, поскольку частицы, которые естественным образом разделяются в течение длительного периода времени, могут быть разделены за гораздо меньшее время.

Скорость центрифугирования определяется угловой скоростью, обычно выражаемой в оборотах в минуту (об/мин), или ускорением, выражаемым как g . Коэффициент преобразования между об/мин и g зависит от радиуса центрифуги ротора . частиц Скорость осаждения при центрифугировании зависит от их размера и формы, центробежного ускорения, объемной доли присутствующих твердых веществ, разницы плотностей между частицей и жидкостью и вязкости . Наиболее распространенным применением является отделение твердых частиц от высококонцентрированных суспензий, которое используется при обработке осадков сточных вод для обезвоживания, когда образуется менее однородный осадок.

Метод центрифугирования имеет широкий спектр промышленных и лабораторных применений; Этот процесс используется не только для разделения двух смешивающихся веществ, но и для анализа гидродинамических свойств макромолекул. Это один из наиболее важных и широко используемых методов исследования в биохимии , клеточной и молекулярной биологии . В химической и пищевой промышленности специальные центрифуги могут обрабатывать непрерывный поток частиц, превращаясь в отделенную жидкость, подобную плазме. Центрифугирование также является наиболее распространенным методом обогащения урана , основанным на небольшой разнице масс между атомами U-238 и U-235 в газообразном гексафториде урана .

Математическая формула

В жидкой суспензии многие частицы или клетки постепенно падают на дно контейнера под действием силы тяжести ; однако время, необходимое для такого разделения, неосуществимо. Другие частицы, которые очень малы, вообще не могут быть изолированы в растворе до тех пор, пока они не подвергнутся воздействию высокой центробежной силы . Поскольку суспензия вращается с определенной скоростью или числом оборотов в минуту (об/мин), центробежная сила позволяет частицам перемещаться радиально от оси вращения. Общая формула для расчета количества оборотов в минуту (об/мин) центрифуги:

$RPM={\sqrt {g \over r}}$,

где g представляет собой относительную центробежную силу (RCF), а r — радиус от центра ротора до точки образца.

Однако в зависимости от используемой модели центрифуги соответствующий угол ротора и радиус могут различаться, поэтому формула изменяется. Например, ротор Sorvall #SS-34 имеет максимальный радиус 10,8 см, поэтому формула принимает вид ${\textstyle RPM=299{\sqrt {g \over r}}}$, что может еще больше упростить ${\textstyle RPM=91{\sqrt {g}}}$.

По сравнению с гравитацией сила частиц называется «относительной центробежной силой» (RCF). Это перпендикулярная сила, действующая на содержимое ротора в результате вращения, всегда относительно силы тяжести Земли, которая измеряет прочность роторов разных типов и размеров. Например, RCF 1000 g означает, что центробежная сила в 1000 раз сильнее гравитационной силы Земли. RCF зависит от скорости вращения в об/мин и расстояния частиц от центра вращения. Наиболее распространенная формула, используемая для расчета RCF:

$RCF=1.118\times 10^{-5}\times r\times (rpm)^{2}$,

где ${\textstyle 1.118\times 10^{-5}}$ является константой; r — радиус, выраженный в сантиметрах , между осью вращения и точкой образца; а об/мин — скорость в оборотах в минуту.

Исторически сложилось так, что многие разделения выполнялись при скорости 3000 об/мин; Грубое определение силы «g», действующей на этой скорости, состоит в том, чтобы умножить радиус центрифугирования на коэффициент 10, поэтому радиус 160 мм дает примерно 1600 x g. Это довольно произвольный подход, поскольку применяемое значение RCF линейно зависит от радиуса, поэтому увеличение радиуса на 10 % означает, что на той же скорости применяется более высокое RCF на 10 %. Грубо говоря, приведенную выше формулу можно упростить до ${\textstyle RCF=10\times r}$с погрешностью всего 0,62%.

в

Микроцентрифуги

Микроцентрифуги представляют собой специально разработанные настольные модели с легкими роторами небольшого объема, способными очень быстро ускоряться примерно до 17 000 об/мин. Это легкие устройства, которые в основном используются для кратковременного центрифугирования образцов объемом примерно до 0,2–2,0 мл. Однако из-за небольших габаритов они легко транспортируются и при необходимости могут эксплуатироваться в холодном помещении. Их можно хранить в холодильнике или нет. Микроцентрифуга обычно используется в исследовательских лабораториях, где небольшие образцы биологических молекул, клеток или ядер необходимо подвергать воздействию высокой RCF в течение относительно коротких интервалов времени. Микроцентрифуги, предназначенные для высокоскоростной работы, могут достигать скорости до 35 000 об/мин, обеспечивая RCF до 30 000×g, и называются высокоскоростными микроцентрифугами.

Низкоскоростные центрифуги

Низкоскоростные центрифуги используются для сбора химических осадков, интактных клеток (животных, растений и некоторых микроорганизмов), ядер, хлоропластов, крупных митохондрий и более крупных фрагментов плазматических мембран. В этих центрифугах также используются градиенты плотности для очистки клеток. Бакет-роторы, как правило, используются очень широко из-за огромной гибкости размера выборки за счет использования адаптеров. Эти машины имеют максимальную скорость ротора менее 10 000 об/мин и варьируются от небольших настольных до больших напольных центрифуг.

Высокоскоростные центрифуги

Высокоскоростные центрифуги обычно используются для сбора микроорганизмов, вирусов , митохондрий , лизосом , пероксисом и неповрежденных трубчатых мембран Гольджи. Большинство простых задач по гранулированию выполняется с помощью роторов с фиксированным углом. Некоторая работа с градиентом плотности для очистки клеток и органелл может выполняться в бакетных роторах или, в случае градиентов Перколла , в роторах с фиксированным углом. Высокоскоростные или сверхскоростные центрифуги могут обрабатывать большие объемы проб: от нескольких десятков миллилитров до нескольких литров. Кроме того, более крупные центрифуги также могут достигать более высоких угловых скоростей (около 30 000 об/мин). Роторы могут поставляться с различными адаптерами для размещения пробирок , бутылей или микротитровальных планшетов различных размеров .

Ультрацентрифугирование

Ультрацентрифугирование использует высокую центробежную силу для изучения свойств биологических частиц на исключительно высоких скоростях. Современные ультрацентрифуги могут вращаться со скоростью до 150 000 об/мин (что эквивалентно 1 000 000 g). Они используются для сбора всех мембранных везикул, полученных из плазматической мембраны, эндоплазматической сети (ЭР) и мембраны Гольджи , эндосом , рибосом , субъединиц рибосом, плазмид , ДНК , РНК и белков в роторах с фиксированным углом. По сравнению с микроцентрифугами или высокоскоростными центрифугами, ультрацентрифуги могут изолировать гораздо более мелкие частицы и, кроме того, в то время как микроцентрифуги и суперцентрифуги разделяют частицы партиями (ограниченные объемы образцов необходимо обрабатывать вручную в пробирках или бутылях), ультрацентрифуги могут разделять молекулы партиями или системы непрерывного потока.

Ультрацентрифугирование используется для разделения макромолекул/исследований кинетики связывания лигандов, отделения различных фракций липопротеинов из плазмы и депротонизации физиологических жидкостей для анализа аминокислот.

Они являются наиболее часто используемыми центрифугами для очистки градиента плотности всех частиц, кроме клеток, и, хотя для этой цели традиционно используются качающиеся бакеты, также используются роторы с фиксированным углом и вертикальные роторы, особенно для самогенерируемых градиентов и может значительно повысить эффективность разделения. Существует два типа ультрацентрифуг: аналитические и препаративные.

Аналитическое

Аналитическое ультрацентрифугирование (AUC) можно использовать для определения свойств макромолекул, таких как форма, масса, состав и конформация. Это широко используемый метод биомолекулярного анализа, используемый для оценки чистоты образца, характеристики механизмов сборки и разборки биомолекулярных комплексов , определения стехиометрии субъединиц , идентификации и характеристики конформационных изменений макромолекул, а также для расчета констант равновесия и термодинамических параметров самоассоциирующихся соединений. и гетероассоциирующие системы. Аналитические ультрацентрифуги включают в себя сканирующую систему оптического обнаружения на основе видимого / ультрафиолетового света для мониторинга в реальном времени хода образца во время вращения.

Образцы центрифугируются с раствором высокой плотности, например сахарозой , хлоридом цезия или йодиксанолом . Раствор высокой плотности может иметь одинаковую концентрацию по всей пробирке («подушка») или меняющуюся концентрацию (« градиент »). Молекулярные свойства можно моделировать с помощью анализа скорости седиментации или анализа седиментационного равновесия. Во время анализа частица или молекулы будут мигрировать через пробирку с разной скоростью в зависимости от их физических свойств и свойств раствора и в конечном итоге образуют шарик на дне пробирки или полосы на различной высоте.

Препаративное

Препаративные ультрацентрифуги часто используются для разделения частиц в зависимости от их плотности, выделения и/или сбора более плотных частиц для сбора в осадок и осветления суспензий, содержащих частицы. Иногда исследователи также используют препаративные ультрацентрифуги, если им нужна гибкость для изменения типа ротора в приборе. Препаративные ультрацентрифуги могут быть оснащены широким спектром различных типов роторов, которые могут вращать образцы разного количества, под разными углами и с разными скоростями.

Процесс фракционирования

В биологических исследованиях фракционирование клеток обычно включает выделение клеточных компонентов при сохранении индивидуальной роли каждого компонента. Обычно образец клеток хранится в суспензии, которая:

• Буферизованный — нейтральный pH, предотвращающий повреждение структуры белков, включая ферменты (которые могут повлиять на ионные связи).
• Изотонический (с равным водным потенциалом) — предотвращает приток или потерю воды органеллами.
• Охлаждение — снижение общей активности фермента, высвобождаемого позже в процедуре.

Центрифугирование является первым этапом большинства фракционирований . С помощью низкоскоростного центрифугирования можно удалить остатки клеток, оставив супернатант, сохраняющий содержимое клетки. Повторное центрифугирование на все более высоких скоростях позволит фракционировать гомогенаты клеток на их компоненты. В общем, чем меньше субклеточный компонент, тем большая центробежная сила необходима для его осаждения. Растворимая фракция любого лизата затем может быть дополнительно разделена на составляющие с использованием различных методов.

Дифференциальное центрифугирование

Дифференциальное центрифугирование — самый простой метод фракционирования центрифугированием. обычно используется для разделения органелл и мембран, обнаруженных в клетках. Органеллы обычно отличаются друг от друга по плотности и размеру, что делает возможным использование дифференциального центрифугирования и центрифугирования в целом. Затем органеллы можно идентифицировать путем тестирования индикаторов, уникальных для конкретных органелл. Наиболее широко используемым применением этого метода является получение сырых субклеточных фракций из гомогената ткани, например, из печени крысы. Частицы разной плотности или размера в суспензии осаждаются с разной скоростью, причем более крупные и плотные частицы осаждаются быстрее. Эти скорости седиментации можно увеличить, используя центробежную силу.

Суспензию клеток подвергают серии циклов возрастающей центробежной силы для получения серии гранул, содержащих клетки со снижающейся скоростью седиментации. Гомогенат включает ядра, митохондрии, лизосомы, пероксисомы, листы плазматической мембраны и широкий спектр везикул, происходящих из ряда внутриклеточных мембранных компартментов, а также из плазматической мембраны, обычно в буферной среде.

плотности

Центрифугирование в градиенте плотности, как известно, является одним из наиболее эффективных методов разделения взвешенных частиц и используется как в качестве метода разделения, так и в качестве метода измерения плотности частиц или молекул в смеси.

Он используется для разделения частиц по размеру, форме и плотности с использованием среды с градиентной плотностью. Во время относительно короткого или медленного центрифугирования частицы разделяются по размеру, причем более крупные частицы оседают дальше, чем более мелкие. При длительном или быстром центрифугировании частицы перемещаются в места градиента, где плотность среды равна плотности частиц; (ρp – ρm) → 0. Следовательно, маленькая плотная частица изначально осаждается хуже, чем крупная частица с низкой плотностью. Крупные частицы рано достигают положения равновесной плотности, тогда как мелкие частицы медленно мигрируют через зону крупных частиц и в конечном итоге занимают положение равновесия глубже в градиенте.

Пробирка после центрифугирования этим методом содержит частицы в порядке плотности в зависимости от высоты. Интересующий объект или частица будет находиться внутри трубки в положении, соответствующем его плотности. Тем не менее, при использовании этого метода все же возможны некоторые неидеальные седиментации. Первой потенциальной проблемой является нежелательная агрегация частиц, но это может произойти при любом центрифугировании. Вторая возможность возникает, когда капли раствора, содержащие частицы, оседают. Это более вероятно произойдет при работе с раствором, в котором слой суспензии плавает на плотной жидкости, которая фактически практически не имеет градиента плотности.

Другие приложения

Центрифугу можно использовать для выделения небольших количеств твердых веществ, находящихся во взвешенном состоянии, из жидкостей, например, при отделении мелового порошка от воды. В биологических исследованиях его можно использовать при очистке клеток млекопитающих, фракционировании субклеточных органелл, фракционировании мембранных везикул, фракционировании макромолекул и макромолекулярных комплексов и т. д. Центрифугирование используется в пищевой промышленности по-разному . Например, в молочной промышленности его обычно используют при осветлении и обезжиривании молока , экстракции сливок, производстве и восстановлении казеина , производстве сыра , удалении бактериальных загрязнений и т. д. Этот метод обработки также используется при производстве напитков. , соки, кофе, чай, пиво, вино , соевое молоко , масел переработка/восстановление и жиров, какао-масло , производство сахара и т. д. Он также используется при осветлении и стабилизации вина .

В судебно-медицинских и исследовательских лабораториях его можно использовать при разделении компонентов мочи и крови . Он также помогает в разделении белков с использованием таких методов очистки, как высаливание , например осаждение сульфатом аммония. Центрифугирование также является важным методом обработки отходов , являясь одним из наиболее распространенных процессов, используемых для обезвоживания осадка . Этот процесс также играет роль в циклонной сепарации , когда частицы отделяются от воздушного потока без использования фильтров . В циклонном коллекторе воздух движется по винтовой траектории. Частицы с высокой инерцией отделяются центробежной силой, в то время как более мелкие частицы продолжают двигаться с потоком воздуха.

Центрифуги также в небольшой степени использовались для выделения соединений легче воды, таких как нефть. В таких ситуациях водный сброс получается на противоположном выходе, из которого твердые вещества с удельным весом больше единицы являются целевыми веществами для отделения.

История

К 1923 г. Теодор Сведберг и его ученик Х. Ринде успешно проанализировали крупнозернистые золи с точки зрения их гравитационной седиментации. Золи состоят из вещества, равномерно распределенного в другом веществе, также известном как коллоид . Однако более мелкие зернистые золи, например, содержащие золото, проанализировать не удалось. Для исследования этой проблемы Сведберг разработал аналитическую центрифугу, оснащенную системой фотографического поглощения, которая оказывала гораздо больший центробежный эффект. Кроме того, он разработал теорию, необходимую для измерения молекулярной массы. За это время внимание Сведберга переключилось с золота на белки.

К 1900 году было общепринято, что белки состоят из аминокислот; однако вопрос о том, являются ли белки коллоидами или макромолекулами , все еще обсуждался. Одним из белков, который исследовался в то время, был гемоглобин . Было установлено, что в нем содержится 712 атомов углерода, 1130 атомов водорода, 243 атома кислорода, два атома серы и по крайней мере один атом железа. Это дало гемоглобину вес примерно 16 000 дальтон (Да), но было неясно, кратно ли это значение одному или четырем (в зависимости от количества присутствующих атомов железа).

В ходе серии экспериментов с использованием метода седиментационного равновесия были сделаны два важных наблюдения: гемоглобин имеет молекулярную массу 68 000 Да, что позволяет предположить, что присутствует четыре атома железа, а не один, и что независимо от того, откуда гемоглобин был изолирован, он имел точно такую ​​же молекулярную массу. То, как можно было постоянно находить что-то с такой большой молекулярной массой, независимо от того, где он был взят в организме, было беспрецедентным и способствовало идее о том, что белки представляют собой макромолекулы, а не коллоиды. Для исследования этого явления потребовалась центрифуга с еще более высокими скоростями, и поэтому была создана ультрацентрифуга для применения теории седиментации-диффузии. Была определена та же молекулярная масса, а наличие растекающейся границы позволило предположить, что это одна компактная частица. Дальнейшее применение центрифугирования показало, что при различных условиях крупные однородные частицы могут распадаться на дискретные субъединицы. Развитие центрифугирования стало большим достижением в экспериментальной науке о белках.

Линдерсторм-Ланг в 1937 году обнаружил, что для измерения плотности можно использовать трубки градиента плотности. Он обнаружил это, работая с вирусом желтой карликовости картофеля. Этот метод также использовался в знаменитом эксперименте Мезельсона и Сталя, в котором они доказали, что репликация ДНК является полуконсервативной с использованием различных изотопов азота. Они использовали центрифугирование в градиенте плотности, чтобы определить, какой изотоп или изотопы азота присутствовали в ДНК после циклов репликации.

См. также

• Центрифуга

Источники

• Харрисон, Роджер Г., Тодд, Пол, Радж, Скотт Р., Петридес Д.П. Наука и техника биосепарации . Издательство Оксфордского университета, 2003.
• Дишон М., Вайс Г.Х. , Ифантис Д.А. Численные решения уравнения Ламма. I. Численная процедура . Биополимеры, Том. 4, 1966. стр. 449–455.
• Као В., Демелер Б. Моделирование аналитических экспериментов по ультрацентрифугированию с помощью адаптивного пространственно-временного конечно-элементного решения для многокомпонентных реагирующих систем . Биофизический журнал, Vol. 95, 2008. стр. 54–65.
• Хоулетт Г.Дж., Минтон А.П., Ривас Г. Аналитическое ультрацентрифугирование для изучения ассоциации и сборки белков . Современное мнение в области химической биологии, Vol. 10, 2006. С. 430–436.
• Дам Дж., Великовский К.А., Мариуцца Р.А. и др. Анализ скорости седиментации гетерогенных межбелковых взаимодействий: моделирование уравнением Ламма и распределения коэффициентов седиментации c(s) . Биофизический журнал, Vol. 89, 2005. С. 619–634.
• Берковиц С.А., Фило Дж.С. Мониторинг гомогенности препаратов аденовируса (системы доставки генной терапии) с использованием аналитического ультрацентрифугирования . Аналитическая биохимия, Том. 362, 2007. С. 16–37.