Дифференциальное центрифугирование
 | Эта статья нуждается в дополнительных цитатах для проверки . ( октябрь 2009 г. ) |
В биохимии и биологии клеточной дифференциальное центрифугирование (также известное как центрифугирование с дифференциальной скоростью ) является распространенной процедурой, используемой для разделения органелл и других субклеточных частиц на основе скорости их седиментации . Хотя дифференциальное центрифугирование часто применяется в биологическом анализе, оно является общим методом, который также подходит для грубой очистки неживых взвешенных частиц (например, наночастиц , коллоидных частиц, вирусов ). В типичном случае, когда дифференциальное центрифугирование используется для анализа клеточно-биологических явлений (например, распределения органелл), образец ткани сначала лизируется , чтобы разрушить клеточные мембраны и высвободить органеллы и цитозоль . Затем лизат подвергают повторному центрифугированию , при котором частицы, которые осаждаются достаточно быстро при заданной центробежной силе в течение заданного времени, образуют компактную «пеллету» на дне центрифужной пробирки. [1]
После каждого центрифугирования супернатант (негранулированный раствор) удаляют из пробирки и повторно центрифугируют при увеличенной центробежной силе и/или времени. Дифференциальное центрифугирование подходит для грубого разделения на основе скорости седиментации, но более мелкозернистую очистку можно провести на основе плотности посредством равновесного центрифугирования в градиенте плотности . [2] Таким образом, метод дифференциального центрифугирования представляет собой последовательное осаждение частиц из предыдущего супернатанта с использованием все более высоких сил центрифугирования. [3] Клеточные органеллы, разделенные дифференциальным центрифугированием, сохраняют относительно высокую степень нормального функционирования до тех пор, пока они не подвергаются денатурирующим условиям во время выделения. [4] [5]
Теория
[ редактировать ]В вязкой жидкости скорость седиментации данной взвешенной частицы (пока частица плотнее жидкости) в значительной степени зависит от следующих факторов:
- Гравитационная сила
- Разница в плотности
- Вязкость жидкости
- Размер и форма частиц
Более крупные частицы оседают быстрее и при меньших центробежных силах. Если частица менее плотна, чем жидкость (например, жиры в воде), частица не будет осаждаться, а будет плавать, независимо от силы перегрузки, испытываемой частицей. Центробежная сила разделяет компоненты не только по плотности, но также по размеру и форме частиц. Напротив, более специализированное центрифугирование с равновесным градиентом плотности дает профиль разделения, зависящий только от плотности частиц, и, следовательно, подходит для более мелкозернистого разделения.
Высокая перегрузка делает седиментацию мелких частиц намного быстрее, чем броуновская диффузия , даже для очень маленьких (наноразмерных) частиц. При использовании центрифуги закон Стокса необходимо изменить, чтобы учесть изменение силы перегрузки в зависимости от расстояния от центра вращения. [6]
где
- D — минимальный диаметр частиц, которые, как ожидается, выпадут в осадок (м).
- жидкости η (или μ) — динамическая вязкость (Па·с).
- R f — конечный радиус вращения (м)
- R i — начальный радиус вращения (м)
- ρ p – объемная массовая плотность частиц (кг/м 3 )
- ρ f – объемная массовая плотность жидкости (кг/м 3 )
- ω - угловая скорость (радиан/с)
- t — время, необходимое для осаждения от R i до R f (с)
Процедура
[ редактировать ]Дифференциальное центрифугирование можно использовать с неповрежденными частицами (например, биологическими клетками, микрочастицами, наночастицами) или использовать для разделения составных частей данной частицы. [7] На примере отделения эукариотических органелл от интактных клеток клетку необходимо сначала лизировать и гомогенизировать (в идеале с помощью щадящего метода, такого как гомогенизация Даунса ; более жесткие методы или чрезмерная гомогенизация приведут к снижению доли интактных органелл). После получения сырого экстракта органелл его можно подвергнуть центрифугированию с различной скоростью для разделения органелл:
| Пример ввода | сила перегрузки | Время | Необходим инструмент | Содержание пеллет | Содержание супернатанта |
|---|---|---|---|---|---|
| Нелизированные (эукариотические) клетки | 100 хг | 5 минут | Настольная центрифуга с фиксированным углом или центрифуга с поворотным стаканом | Интактные (эукариотические) клетки, макроскопический мусор | Зависит от образца |
| Аккуратно лизированные клетки (например, гомогенизатор Дауна) | 600 хг | 10 мин. | Настольная центрифуга с фиксированным углом или центрифуга с поворотным стаканом | Ядра | Цитозоль, неядерные органеллы |
| Супернатант предыдущего ряда | 15 000 хг | 20 мин. | Настольная центрифуга с фиксированным углом | Митохондрии, хлоропласты, лизосомы, пероксисомы | Цитозоль, микросомы (известные как постмитохондриальный супернатант) |
| Супернатант предыдущего ряда | 50 000 кг - 100 000 кг | 60 мин. | Высокоскоростная угловая центрифуга или вакуумная ультрацентрифуга. | Плазматическая мембрана, микросомальная фракция, крупные полирибосомы. | Цитозоль, субъединицы рибосом, малые полирибосомы, ферментные комплексы |
| Супернатант предыдущего ряда | 50 000 кг - 100 000 кг | 120 мин. | Вакуумная ультрацентрифуга | Рибосомальные субъединицы, небольшие полирибосомы, некоторые растворимые ферментные комплексы. | Цитозоль |
Ультрацентрифугирование
[ редактировать ]Лизированный образец теперь готов к центрифугированию в ультрацентрифуге . Ультрацентрифуга состоит из охлаждаемой камеры низкого давления, содержащей ротор, который приводится в движение электродвигателем, способным вращаться с высокой скоростью. Образцы помещаются в пробирки внутри ротора или прикрепляются к нему. Скорость вращения может достигать 100 000 об/мин для напольной модели и 150 000 об/мин для настольной модели (Beckman Optima Max-XP, Sorvall MTX150 или hisac CS150NX), создавая центробежные скорости от 800 000 до 1 000 000 g. Эта сила вызывает седиментацию макромолекул и может даже вызвать неравномерное распределение небольших молекул. [8]
Поскольку разные фрагменты клетки имеют разные размеры и плотность, каждый фрагмент осядет в осадок с разной минимальной центробежной силой. Таким образом, разделение образца на разные слои можно осуществить, сначала центрифугируя исходный лизат при слабых силах, удаляя осадок, а затем подвергая последующие супернатанты воздействию последовательно более сильных центробежных полей. Каждый раз порция разной плотности оседает на дно контейнера и извлекается, а при повторном нанесении образуется ряд слоев, включающий разные части исходного образца. Дополнительные шаги могут быть предприняты для дальнейшего улучшения каждой из полученных гранул.
Седиментация зависит от массы, формы и парциального удельного объема макромолекулы, а также плотности растворителя, размера ротора и скорости вращения. Скорость седиментации можно контролировать во время эксперимента для расчета молекулярной массы .Значения коэффициента седиментации (S) можно рассчитать. Большие значения S (более высокая скорость седиментации) соответствуют большей молекулярной массе. Плотные частицы оседают быстрее. Удлиненные белки имеют более высокие коэффициенты трения и оседают медленнее, чтобы обеспечить точность. [9]
Различия между дифференциальным центрифугированием и центрифугированием в градиенте плотности
[ редактировать ]Разница между методами дифференциального центрифугирования и центрифугирования в градиенте плотности заключается в том, что в последнем методе используются растворы разной плотности (например, сахароза , фиколл , перколл ) или гели, через которые проходит образец. При этом образец разделяется на слои по относительной плотности, основанный на принципе, согласно которому молекулы оседают под действием центробежной силы, пока не достигнут среды с такой же плотностью, как и у них. [10] Степень разделения или количество слоев зависит от раствора или геля. С другой стороны, дифференциальное центрифугирование не использует градиент плотности, и центрифугирование проводится с возрастающей скоростью. Различные скорости центрифугирования часто приводят к разделению не более чем на две фракции, поэтому супернатант можно дополнительно разделить на дополнительных этапах центрифугирования. Для этого на каждом этапе скорость центрифугирования необходимо увеличивать до тех пор, пока желаемые частицы не будут отделены. Напротив, центрифугирование в градиенте плотности обычно выполняется только с одной скоростью центрифугирования. [11]
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Олендик, Кей; Хардинг, Стивен Э. (19 апреля 2018 г.). «Центрифугирование и ультрацентрифугирование». Принципы и методы биохимии и молекулярной биологии Уилсона и Уокера : 424–453. дои : 10.1017/9781316677056.014 . ISBN 9781107162273 .
- ^ Jump up to: а б Дарнелл, Джеймс; Балтимор, Дэвид; Мацудайра, Пол; Зипурски, С. Лоуренс; Берк, Арнольд; Лодиш, Харви (2000). «Очистка клеток и их частей» .
{{cite journal}}: Для цитирования журнала требуется|journal=( помощь ) - ^ Гриффит, Оуэн Митч (2010). Практические методы центробежного разделения – Руководство по применению (PDF) . Принципы и методы биохимии и молекулярной биологии. стр. 1–27. Архивировано из оригинала (PDF) 7 февраля 2023 г. Проверено 14 октября 2020 г.
- ^ Джеральд Карп (19 октября 2009 г.). Клеточная и молекулярная биология: концепции и эксперименты . Джон Уайли и сыновья. стр. 28–. ISBN 978-0-470-48337-4 .
- ^ Лившиц Михаил А.; Хомякова, Елена; Евтушенко Евгений Георгиевич; Лазарев Василий Н.; Кулемин Николай А.; Семина Светлана Евгеньевна; Генерозов, Эдуард Васильевич; Говорун, Вадим М. (30 ноября 2015 г.). «Выделение экзосом дифференциальным центрифугированием: теоретический анализ широко используемого протокола» . Научные отчеты . 5 (1): 17319. Бибкод : 2015NatSR...517319L . дои : 10.1038/srep17319 . ISSN 2045-2322 . ПМЦ 4663484 . ПМИД 26616523 . S2CID 14200669 .
- ^ Хардинг, Стивен Э.; Скотт, Дэвид; Роу, Артер (16 декабря 2007 г.). Аналитическое ультрацентрифугирование: техника и методы . Королевское химическое общество. ISBN 978-1-84755-261-7 .
- ^ Фрей, Марк. «Центрифугирование» . Биофайлы . 6 (5): 6–7.
- ^ Тейлор, Дуглас Д.; Шах, Сахил (1 октября 2015 г.). «Методы выделения внеклеточных везикул влияют на последующий анализ их грузов». Методы . 87 : 3–10. дои : 10.1016/j.ymeth.2015.02.019 . ПМИД 25766927 .
- ^ Вэнс, Деннис Э.; Вэнс, JE (6 августа 1996 г.). «Строение, сборка и секреция липопротеинов» . Биохимия липидов, липопротеинов и мембран . Эльзевир. ISBN 978-0-08-086092-3 .
- ^ Сапкота, Анупама (3 сентября 2020 г.). «Типы центрифуг и центрифугирования (определение, принцип, использование)» . Микробные заметки .
- ^ Ю, Ли-Ли; Чжу, Цзин; Лю, Цзинь-Ся; Цзян, Фэн; Ни, Вэнь-Кай; Цюй, Ли-Шуай; Ни, Жунь-Чжоу; Лу, Цуй-Хуа; Сяо, Мин-Бин (2018). «Сравнение традиционных и новых методов выделения экзосом из образцов человека» . БиоМед Исследования Интернэшнл . 2018 : 1–9. дои : 10.1155/2018/3634563 . ПМК 6083592 . ПМИД 30148165 .
